襲辰辰　馮艷春　胡昌勤

摘要在玻碳電極表面修飾碳納米管，并用多電位階躍法在碳納米管表面沉積納米金制得碳納米管/納米金復合膜。通過納米金和微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）抗體之間的吸附作用，將抗微囊藻單克隆抗體固定于電極表面，以牛血清白蛋白封閉非特異性吸附位點，研制了檢測微囊藻毒素的電化學免疫傳感器。利用微囊藻毒素與其抗體之間的特異性識別作用構建“三明治”夾心結構的免疫分析模式，以辣根過氧化物酶標記抗體為二抗，利用微分脈沖伏安法實現(xiàn)了對微囊藻毒素的檢測。在優(yōu)化條件下，此傳感器的響應電流與微囊藻毒素濃度在0.50～12.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，檢出限為0.30 μg/L（S/N=3）。對實際水樣進行了微囊藻毒素的加標回收實驗，回收率在93.0%～108.5%之間，相對標準偏差為3.8%～5.0%。

關鍵詞微囊藻毒素； 碳納米管/納米金復合膜； 電化學免疫傳感器

1引言

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是由淡水藍綠藻產(chǎn)生的一類毒性強、急性危害大的環(huán)七肽縮氨酸肝毒素，對水生生物、人類飲用水安全和人類健康產(chǎn)生嚴重影響＼[1，2＼]。其中， 微囊藻毒素（亮氨酸精氨酸）（Microcystin（leucinearginine），MCLR）是最常見、急性毒性最大的微囊藻毒素之一＼[3，4＼]，水體中MCLR的含量已被多個國家和組織作為衡量水質標準的一個重要指標＼[5＼]。目前， 檢測水體中MCLR的傳統(tǒng)方法中，高效液相色譜法、高效液相色譜質譜聯(lián)用技術檢測效果較好，但其儀器設備價值昂貴、操作繁瑣且對操作人員技術要求較高；植物細胞的生物測試法和蛋白磷酸酶抑制法靈敏度相對較低；酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度較高，但其線性范圍較窄＼[6～10＼]。在傳統(tǒng)檢測方法得到廣泛應用的同時，研究者不斷將新技術引入到MCLR測定中，以期待建立更快速、更靈敏的MCLR檢測方法。

電化學免疫傳感器將免疫反應的特異性和電化學的便捷性相結合，具有靈敏度高、特異性強、快速方便、可微型化和容易實現(xiàn)在線檢測等優(yōu)點＼[11，12＼]，在測定MCLR的研究中展現(xiàn)出較好的應用前景＼[13＼]。在發(fā)展電化學免疫傳感器的過程中，抗體的有效固定及其活性保持和電化學信號的放大是關鍵的問題＼[14＼]。納米材料由于其特殊的電化學性質而備受關注＼[15＼]。其中，納米復合膜在增大材料的比表面積、提高表面反應活性、改善催化反應的動力學條件等方面突破了單一組分材料性能的局限，表現(xiàn)出良好的生物親和性、導電性、高催化活性等突出優(yōu)點＼[16＼]，使其更適合應用于電化學分析領域?；谔技{米管（CNTs）和納米金（AuNPs）的優(yōu)良特性＼[17＼]，本研究制備了碳納米管/納米金復合膜，并將其用于構建電化學免疫傳感器檢測水體中MCLR，此傳感器表現(xiàn)出了較高的靈敏度和較好的選擇性，具有較寬的測量范圍。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

CHI 660C型電化學工作站（上海辰華儀器公司），電化學反應池為三電極體系：以玻碳電極為基底的免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極；S4800型掃描電子顯微鏡（SEM， Hitachi公司）。

辣根過氧化物酶（HRP）、牛血清白蛋白（BSA）、HAuCl4·3H2O（美國Sigma公司）；MCLR標準品、antiMCLR單抗和多抗（北京伊普瑞斯科技有限公司）；HRP標記的antiMCLR多抗（antiMCLRHRP）依據(jù)參考文獻＼[11＼]制備；碳納米管（CNTs）購于深圳納米港，并按文獻＼[17＼]方法進行純化，將純化好的碳納米管溶于N，N二甲基甲酰胺制得碳納米管溶液（0.10 mg/mL）；其它試劑均購于國藥集團化學試劑公司。實驗所用試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水（電阻率為18 MΩ·cm）。稀釋液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH 7.4），置于4 ℃的冰箱中保存。洗滌液為稀釋液加入0.05% Tween20， 封閉液為含有2%牛血清白蛋白的PBS。

2.2免疫傳感器的制備

玻碳電極（GCE， Φ=3 mm）用Al2O3拋光至鏡面，依次用丙酮、1.0 mol/L HNO3、1.0 mol/L NaOH及二次蒸餾水超聲清洗5 min。將處理好的玻碳電極吹干后，滴涂10 μL 碳納米管溶液，并在紅外燈下烘干。將制得的GCE/CNT電極放入含有0.10 mmol/L HAuCl4的H2SO4溶液（0.50 mol/L）中，用多電位階躍的方法在電極表面沉積納米金（在1.055～

Symbolm@@ 0.045 V 的階躍電位范圍內(nèi)掃描15 s）制備GCE/CNT/AuNP電極。將電極用二次蒸餾水清洗并吹干后，滴涂10 μL antiMCLR單抗，并在37 ℃條件下孵育60 min， 然后用洗滌液清洗電極以除去未結合的抗體并晾干。在電極表面滴加10 μL 封閉液，孵育30 min以封閉活性位點。

2.3電化學檢測

將制備的免疫傳感器清洗并吹干后，放入一定濃度的MCLR溶液中，在37 ℃下培養(yǎng)60 min。用洗滌液清洗電極后，將10 μL antiMCLRHRP滴于電極表面并放置60 min。然后，用水清洗電極并將其放入5 mL含有0.80 mmol/L H2O2和0.50 mmol/L對苯二酚的PBS中，用微分脈沖伏安法進行定量檢測，掃描范圍為

Symbolm@@ 0.6～0.4 V。以對苯二酚為電子媒介體，通過HRP催化H2O2產(chǎn)生的響應電流實現(xiàn)對MCLR的檢測。電化學交流阻抗（EIS）測試條件：應用電位0.20 V，振幅0.05 V，頻率為0.10 Hz～100 kHz， 靜置時間2 s；循環(huán)伏安（CV）測試條件：電壓范圍

3結果與討論

3.1免疫傳感器的掃描電子顯微鏡圖和電化學表征

用掃描電子顯微鏡表征修飾電極（GCE/CNT和GCE/CNT/AuNP）的表面形貌。圖2A表明，大部分納米管以小束或單管的形式分布于玻碳電極的表面。如圖2B所示，納米金在碳納米管表面的分布具有一致性，該納米結構具有比表面積大、穩(wěn)定性好和傳導性高等優(yōu)點。

作為氧化還原探針，采用交流阻抗法考察了電極表面的修飾過程（圖3A）。裸玻碳電極的電子轉移阻抗值（Ret）約為160 Ω（曲線a），當電極修飾碳納米管后， Ret明顯減?。ㄇ€b）。電沉積納米金后，電極的導電性能進一步提高（曲線c），表明CNT/AuNP復合膜作為良好的導電材料有效促進了電子傳遞。當antiMCLR與電極表面納米金結合后，抗體作為非導電性物質阻礙了電子傳遞（曲線d），Ret明顯增大。依次加入MCLR與antiMCLRHRP后（曲線e，f），Ret逐步增大，證明二者先后結合在電極表面。

將修飾電極GCE/CNT/AuNP/antiMCLR/MCLR/antiMCLRHRP在不同條件下進行循環(huán)伏安掃描用于測定電極表面HRP的電化學行為（圖3B）。實驗發(fā)現(xiàn)，該傳感器在空白PBS中具有很低的背景電流（曲線a）。在PBS中加入對苯二酚后，可以觀察到一對明顯的氧化還原峰（曲線b）。當H2O2加入到上述溶液中后，還原峰峰電流明顯增加且峰電位向負方向移動（曲線c），顯示了電極的催化特征，說明HRP已固定在免疫傳感器的表面并保持了良好的催化活性。

3.2免疫傳感器的性能比較

選用不同材料（CNTs，AuNPs，CNT/AuNP）分別修飾玻碳電極制備電化學免疫傳感器并比較其性能。圖4顯示CNT/AuNP復合膜修飾玻碳電極的電化學免疫傳感器獲得了最高響應電流，表明CNT/AuNP復合膜對放大信號從而提高檢測靈敏度起著十分重要的作用。這是由于該復合膜具有一致的納米結構，能夠增大電極的比表面積、增強機械穩(wěn)定性和導電性、增加了抗體在電極表面的固載量并可以保持其良好的生物活性。

3.3微囊藻毒素測定條件的優(yōu)化

溫度和時間是影響免疫反應的重要因素。本研究在23～43 ℃范圍內(nèi)考察了溫度對電化學免疫傳感器檢測MCLR的影響。結果表明，隨著溫度升高，響應電流逐步增強，在37 ℃獲得最大響應電流。當高于此溫度時，響應電流下降，因此最佳免疫反應溫度選擇37 ℃。同時，響應電流隨著免疫反應時間的延長而增強，在60 min時，響應電流趨于穩(wěn)定，因此最佳免疫反應時間選擇60 min。

對苯二酚和H2O2的濃度是影響電化學酶催化分析的重要因素。實驗表明，電流信號分別隨著兩者的濃度增大而增強，并且分別在0.50 mmol/L對苯二酚和0.80 mmol/L H2O2時達到最大電流值，因此對苯二酚和H2O2的最優(yōu)濃度選擇分別0.50和0.80 mmol/L。

3.4傳感器的標準曲線及檢出限

在優(yōu)化條件下，對不同濃度的MCLR進行測定（圖5）。響應電流與MCLR濃度在0.50～12.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系（圖5插圖），線性方程為Y （μA）=1.960+0.533X（μg/L）（R2=0.9952， n=5），檢出限達到0.30 μg/L（S/N=3）。結果表明，此電化學免疫傳感器檢測MCLR的靈敏度高，[TS（]圖5免疫傳感器對不同濃度MCLR的響應（從a到f濃度分別為： 0.50， 2， 4， 7， 10， 12 μg/L）。

3.5傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性研究

對不同批次制備的免疫傳感器進行了測試。對4個濃度（1，3，5和7 μg/L）MCLR分別測定5次，批內(nèi)的相對標準偏差（RSD）分別為5.3%，6.7%，6.9%和7.2%，批間的RSD分別為5.0%，7.5%，6.3%和4.8%，表明此傳感器具有良好的制備重現(xiàn)性。

將制備的免疫傳感器置于4 ℃冰箱保存1星期后，用于檢測10 μg/L MCLR，所得響應電流值為初始值的95.2%；置于4 ℃冰箱保存3星期后，檢測10 μg/L MCLR，所得響應電流值為初始值的87.9%，表明此傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3.6干擾實驗

淡水水體中其它藍藻毒素，如節(jié)球藻毒素、魚腥藻毒素a和石房蛤毒素等對MCLR的測定可能產(chǎn)生影響。在7 μg/L MCLR溶液中分別加入7 μg/L節(jié)球藻毒素、魚腥藻毒素a和石房蛤毒素，發(fā)現(xiàn)在其它藍藻毒素存在時，檢測MCLR產(chǎn)生的響應電流信號（分別為5.42， 5.5和5.53 μA）與單獨測定MCLR產(chǎn)生的響應電流信號（5.7 μA）相差不大，表明其它藍藻毒素的存在對MCLR的測定無明顯影響，證實了此傳感器具有良好的選擇性。

3.7樣品分析

分別取實驗室自來水、桶裝飲用水、鎮(zhèn)江市玉帶河（水樣有一定濁度，測定之前用孔徑0.45 μm的濾膜抽濾水樣）和太湖水樣（水樣中有藻類殘余，且濁度較大，取樣后冰凍保存帶回，并保存在4 ℃冰箱中，測定前用孔徑0.45 μm的濾膜抽濾水樣），采用本方法分別檢測，結果見表1。利用標準加入法向其中加入適量MCLR進行檢測，其回收率為93.0%～108.5%，相對標準偏差（RSD）為3.8%～5.0%，表明此電化學免疫傳感器用于實際水樣的檢測可靠性好、準確度高。

4結論

基于CNT/AuNP復合膜發(fā)展了一種用于水體中MCLR檢測的電化學免疫傳感器。實驗表明，CNT/AuNP復合膜能夠有效增強電極的導電性、增加抗體在電極表面的固載量并保持其良好的生物活性，對信號放大從而提高靈敏度起著重要的作用。此傳感器制備簡單、可靠性好、準確度高，對MCLR的檢測具有線性范圍寬、檢出限低等優(yōu)點。實際水樣的加標回收實驗結果表明該電化學免疫傳感器技術在水體中MCLR檢測方面具有良好的應用前景。

References

1Poste A E， Hecky R E， Guildford S J. Environ. Sci. Technol.， 2011， 45： 5806-5811

2ZHANG JinGuo， KANG TianFang， XUE Rui， SUN Xue. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1353-l358

張金果， 康天放， 薛 瑞， 孫 雪. 分析化學， 2013， 41（9）： 1353-1358

3Tong P， Tang S R， He Y， Shao Y H， Zhang L， Chen G N. Microchim. Acta， 2011， 173： 299-305

4Long F， He M， Zhu A N， Shi H C. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24： 2346-2351

5Draper W M， Xu D D， Perera S K. Anal. Chem.， 2009， 81（10）： 4153-4160

6Metcalf J S， Hyenstrand P， Beattie K A， Codd G A. J. Appl. Microbiol.， 2000， 89： 532-538

7Li C M， Chu R Y Y， Hsientang Hsieh D P H. J. Mass Spectrum.， 2006， 41（2）： 169-174

8Sheng J W， He M， Shi H C. Anal. Chim. Acta， 2007， 603（1）： 111-118

9Gehringer M M， Kewada V， Coates N， Downing T G. Toxicon， 2003， 41（7）： 871-876

10Fontal O I， Vieytes M R， Baptista S J M， Louzao M C， Botana L M. Anal. Biochem.， 1999， 269（2）： 289-296

11Zhang J， Lei J P， Xu C L， Ding L， Ju H X. Anal. Chem.， 2010， 82（3）： 1117-1122

12Lou Y， He T， Jiang F， Shi J J， Zhu J J. Talanta， 2014， 122： 135-139

13Li R Y， Xia Q F， Li Z J， Sun X L， Liu J K. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 235-240

14LIU HuiJie， ZHANG XinAi， TENG YingQiao， ZHANG Wen， JIN LiTong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（A03）： 283-284

劉慧杰， 張新愛， 滕英巧， 張 文， 金利通. 分析化學， 2009， 37（A03）： 283-284

15Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Xu L L， Zhang S P， He B， Wang C G， Zhang W. Anal. Chem.， 2010， 82（22）： 9455-9460

16Lian W J， Liu S， Yu J H， Li J， Cui M， Xu W， Huang J D. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 70-76

17Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Zhang S P， Wang T， Wang C G， Jin L T， Zhang W. Chem. Sci.， 2011， 2： 2353-2360

18WHO. Guidelines for DrinkingWater Quality， 3rd ED， Geneva： World Health Organization， 2004： 407-408

AbstractCarbon nanotubes/Au nanoparticles （CNT/AuNP） composite film was fabricated on glassy carbon electrode （GCE） by first dropping CNTs on the electrode surface and then electrodeposition of AuNPs by multipotential step. The antibody of microcystin（leucinearginine） （antiMCLR） was immobilized on the modified electrode surface through adsorption on AuNPs. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption to obtain the immunosensor for MCLR assay. The immunosensor could effectively capture MCLR by the specific immunoreaction between the electrode surfaceconfined antibody and MCLR， followed by the attachment of the antiMCLR HRPlabeled to form a sandwichtype system. The analysis of MCLR was performed based on the catalytic reaction of HRP toward the oxidation of hydroquinone （QH2） by H2O2. Under the optimal experimental conditions， the peak current response increased linearly with the concentration of MCLR in the range of 0.50-12 μg/L with a detection limit of 0.30 μg/L （S/N=3）. The developed immunosensor was used to determine MCLR in real water samples， and the recoveries of standard addition experiments were in the range of 93.0%-108.5%， with the relative standard deviation of 3.8%-5.0%.

KeywordsMicrocystins； Carbon nanotubes/gold nanoparticles composite film； Electrochemical immunosensor

1Poste A E， Hecky R E， Guildford S J. Environ. Sci. Technol.， 2011， 45： 5806-5811

2ZHANG JinGuo， KANG TianFang， XUE Rui， SUN Xue. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1353-l358

張金果， 康天放， 薛 瑞， 孫 雪. 分析化學， 2013， 41（9）： 1353-1358

3Tong P， Tang S R， He Y， Shao Y H， Zhang L， Chen G N. Microchim. Acta， 2011， 173： 299-305

4Long F， He M， Zhu A N， Shi H C. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24： 2346-2351

5Draper W M， Xu D D， Perera S K. Anal. Chem.， 2009， 81（10）： 4153-4160

6Metcalf J S， Hyenstrand P， Beattie K A， Codd G A. J. Appl. Microbiol.， 2000， 89： 532-538

7Li C M， Chu R Y Y， Hsientang Hsieh D P H. J. Mass Spectrum.， 2006， 41（2）： 169-174

8Sheng J W， He M， Shi H C. Anal. Chim. Acta， 2007， 603（1）： 111-118

9Gehringer M M， Kewada V， Coates N， Downing T G. Toxicon， 2003， 41（7）： 871-876

10Fontal O I， Vieytes M R， Baptista S J M， Louzao M C， Botana L M. Anal. Biochem.， 1999， 269（2）： 289-296

11Zhang J， Lei J P， Xu C L， Ding L， Ju H X. Anal. Chem.， 2010， 82（3）： 1117-1122

12Lou Y， He T， Jiang F， Shi J J， Zhu J J. Talanta， 2014， 122： 135-139

13Li R Y， Xia Q F， Li Z J， Sun X L， Liu J K. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 235-240

14LIU HuiJie， ZHANG XinAi， TENG YingQiao， ZHANG Wen， JIN LiTong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（A03）： 283-284

劉慧杰， 張新愛， 滕英巧， 張 文， 金利通. 分析化學， 2009， 37（A03）： 283-284

15Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Xu L L， Zhang S P， He B， Wang C G， Zhang W. Anal. Chem.， 2010， 82（22）： 9455-9460

16Lian W J， Liu S， Yu J H， Li J， Cui M， Xu W， Huang J D. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 70-76

17Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Zhang S P， Wang T， Wang C G， Jin L T， Zhang W. Chem. Sci.， 2011， 2： 2353-2360

18WHO. Guidelines for DrinkingWater Quality， 3rd ED， Geneva： World Health Organization， 2004： 407-408

AbstractCarbon nanotubes/Au nanoparticles （CNT/AuNP） composite film was fabricated on glassy carbon electrode （GCE） by first dropping CNTs on the electrode surface and then electrodeposition of AuNPs by multipotential step. The antibody of microcystin（leucinearginine） （antiMCLR） was immobilized on the modified electrode surface through adsorption on AuNPs. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption to obtain the immunosensor for MCLR assay. The immunosensor could effectively capture MCLR by the specific immunoreaction between the electrode surfaceconfined antibody and MCLR， followed by the attachment of the antiMCLR HRPlabeled to form a sandwichtype system. The analysis of MCLR was performed based on the catalytic reaction of HRP toward the oxidation of hydroquinone （QH2） by H2O2. Under the optimal experimental conditions， the peak current response increased linearly with the concentration of MCLR in the range of 0.50-12 μg/L with a detection limit of 0.30 μg/L （S/N=3）. The developed immunosensor was used to determine MCLR in real water samples， and the recoveries of standard addition experiments were in the range of 93.0%-108.5%， with the relative standard deviation of 3.8%-5.0%.

KeywordsMicrocystins； Carbon nanotubes/gold nanoparticles composite film； Electrochemical immunosensor

1Poste A E， Hecky R E， Guildford S J. Environ. Sci. Technol.， 2011， 45： 5806-5811

2ZHANG JinGuo， KANG TianFang， XUE Rui， SUN Xue. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1353-l358

張金果， 康天放， 薛 瑞， 孫 雪. 分析化學， 2013， 41（9）： 1353-1358

3Tong P， Tang S R， He Y， Shao Y H， Zhang L， Chen G N. Microchim. Acta， 2011， 173： 299-305

4Long F， He M， Zhu A N， Shi H C. Biosens. Bioelectron.， 2009， 24： 2346-2351

5Draper W M， Xu D D， Perera S K. Anal. Chem.， 2009， 81（10）： 4153-4160

6Metcalf J S， Hyenstrand P， Beattie K A， Codd G A. J. Appl. Microbiol.， 2000， 89： 532-538

7Li C M， Chu R Y Y， Hsientang Hsieh D P H. J. Mass Spectrum.， 2006， 41（2）： 169-174

8Sheng J W， He M， Shi H C. Anal. Chim. Acta， 2007， 603（1）： 111-118

9Gehringer M M， Kewada V， Coates N， Downing T G. Toxicon， 2003， 41（7）： 871-876

10Fontal O I， Vieytes M R， Baptista S J M， Louzao M C， Botana L M. Anal. Biochem.， 1999， 269（2）： 289-296

11Zhang J， Lei J P， Xu C L， Ding L， Ju H X. Anal. Chem.， 2010， 82（3）： 1117-1122

12Lou Y， He T， Jiang F， Shi J J， Zhu J J. Talanta， 2014， 122： 135-139

13Li R Y， Xia Q F， Li Z J， Sun X L， Liu J K. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 235-240

14LIU HuiJie， ZHANG XinAi， TENG YingQiao， ZHANG Wen， JIN LiTong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（A03）： 283-284

劉慧杰， 張新愛， 滕英巧， 張 文， 金利通. 分析化學， 2009， 37（A03）： 283-284

15Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Xu L L， Zhang S P， He B， Wang C G， Zhang W. Anal. Chem.， 2010， 82（22）： 9455-9460

16Lian W J， Liu S， Yu J H， Li J， Cui M， Xu W， Huang J D. Biosens. Bioelectron.， 2013， 44： 70-76

17Zhang X A， Teng Y Q， Fu Y， Zhang S P， Wang T， Wang C G， Jin L T， Zhang W. Chem. Sci.， 2011， 2： 2353-2360

18WHO. Guidelines for DrinkingWater Quality， 3rd ED， Geneva： World Health Organization， 2004： 407-408

AbstractCarbon nanotubes/Au nanoparticles （CNT/AuNP） composite film was fabricated on glassy carbon electrode （GCE） by first dropping CNTs on the electrode surface and then electrodeposition of AuNPs by multipotential step. The antibody of microcystin（leucinearginine） （antiMCLR） was immobilized on the modified electrode surface through adsorption on AuNPs. Subsequently， bovine serum albumin （BSA） was used to block the nonspecific adsorption to obtain the immunosensor for MCLR assay. The immunosensor could effectively capture MCLR by the specific immunoreaction between the electrode surfaceconfined antibody and MCLR， followed by the attachment of the antiMCLR HRPlabeled to form a sandwichtype system. The analysis of MCLR was performed based on the catalytic reaction of HRP toward the oxidation of hydroquinone （QH2） by H2O2. Under the optimal experimental conditions， the peak current response increased linearly with the concentration of MCLR in the range of 0.50-12 μg/L with a detection limit of 0.30 μg/L （S/N=3）. The developed immunosensor was used to determine MCLR in real water samples， and the recoveries of standard addition experiments were in the range of 93.0%-108.5%， with the relative standard deviation of 3.8%-5.0%.

KeywordsMicrocystins； Carbon nanotubes/gold nanoparticles composite film； Electrochemical immunosensor