劉燕青　趙啟軍　何羽強(qiáng)等

【摘要】 目的：觀察嗅鞘細(xì)胞（OECs）聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）對(duì)大鼠急性脊髓損傷及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3（NT-3）表達(dá)的影響。方法：SD大鼠80只，Allens法行急性脊髓損傷造模后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（假手術(shù)組）、實(shí)驗(yàn)1組（NSCs移植組）、實(shí)驗(yàn)2組（OECs移植組）和實(shí)驗(yàn)3組（NSCs+OECs聯(lián)合移植組）。局部注射法進(jìn)行細(xì)胞移植。于術(shù)前和術(shù)后1、3、5、7、14、21、28 d，采用BBB評(píng)分法、改良的Tralov評(píng)分法和斜板實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能狀況進(jìn)行評(píng)分，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP N1波）潛伏期的檢測(cè)。最后，各組隨機(jī)抽取一只大鼠進(jìn)行灌注、取材與固定，免疫組織化學(xué)染色的方法觀察各組NT-3在局部受損脊髓組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：（1）造模及細(xì)胞移植術(shù)后，24 h時(shí)內(nèi)各組大鼠BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分均為0分；斜板實(shí)驗(yàn)角度下降非常明顯，由實(shí)驗(yàn)前（82.00±3.45）°降為（12.73±1.34）°，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長(zhǎng)。（2）隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況：各實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分與對(duì)照組比較增高顯著（P<0.05）；1周后各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）斜板實(shí)驗(yàn)角度也逐漸增加，1周后，實(shí)驗(yàn)組增幅大于對(duì)照組（P<0.05）；1周后各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）各組MEP（N1波）潛伏期均逐漸縮短，3 d后，各實(shí)驗(yàn)組潛伏期縮短幅度均大于對(duì)照組（P<0.05）；3 d后各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（5）各組大鼠受損脊髓組織中NT-3均有明顯增高，7 d內(nèi)維持在較高的水平，此后逐漸減少。其中從第5天開(kāi)始，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：（1）細(xì)胞移植治療大鼠急性脊髓損傷時(shí)，單種細(xì)胞單獨(dú)移植，OECs的治療修復(fù)效果要強(qiáng)于NSCs的治療修復(fù)效果，OECs與NSCs聯(lián)合移植取得的治療修復(fù)效果最好。（2）NT-3在OECs與NSCs細(xì)胞聯(lián)合移植組中表達(dá)最高。

【關(guān)鍵詞】 嗅鞘細(xì)胞； 神經(jīng)干細(xì)胞； 急性脊髓損傷； 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3

【Abstract】 Objective：To observe the impact of olfactory ensheathing cells combined neural stem cells in rats with acute spinal cord injury and neurotrophin-3 Expression.Method：80 SD rats were selected， after acute spinal cord injury modeling by Allen's method， the rats were randomly divided into the control group （sham group）， the experimental 1 group （NSCs transplantation group）， the experimental 2 group （OECs transplantation group） and the experimental 3 group （NSCs+OECs transplantation group）. Cells were used local injection method to transplant. In the preoperative and postoperative 1， 3， 5， 7， 14， 21， 28 days， adopt BBB score， improved Tralov score and inclined plane experiments were used to rate the status of rats hindlimb motor function， tested motor evoked potential（MEP N1 wave） preclinical. Finally， one rat in each group were selected， randomly， then perfused， drawn and fixed. Immunohistochemical staining were used to observe neurotrophin-3（NT-3） in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group. Result：（1）After modeling and cell transplanting， the rats BBB rating and improved Tralov score was 0 points within 24 hours， inclined plane experiments angle decreased very significantly， from the previous experiment（82.00±3.45） ° reduced to（12.73±1.34） °（P<0.05）.Each groups MEP （N1 wave） latency was prolonged. （2）As the experiment progresses， the groups had shown varying degrees of recovery. Compared with the control group， the BBB score and improved Tralov score of the experimental group were increased significantly （P<0.05）； after 1 week， the differences of each group in each time point were statistically significant （P<0.05）， and the differences in each two of the experimental group were statistically significant （P<0.05）.（3）Oblique plate experiment angle also gradually increased， after 1 week， the experimental group was increased than the control group （P<0.05）； after 1 week， the differences of each group in each time point were statistically significant （P<0.05）， and the differences in each two of the experimental group were statistically significant （P<0.05）. （4）MEP （N1 wave） of each groups were gradually shortened in the incubation period； after 3 d， the incubation period shorten amplitude of the experimental group were greater than the control group （P<0.05）； after 3 d， the differences of each group in each time point were statistically significant （P<0.05）， and the differences in each two of the experimental group were statistically significant （P<0.05）.（5）The NT - 3 of damaged spinal cord tissue rats in each groups were significantly higher， 7 d maintain at a high level， then gradually reduced. Since 5 days， the difference of the experimental group and the control group was statistically significant （P<0.05）； the differences of each group in each time point were statistically significant （P<0.05）， and the differences in each two of the experimental group were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：（1）When a single cell specie transplant to treat acute spinal cord injury alone， OECs transplantation has better restoration treatment effect than NSCs transplantation. OECs and NSCs transplantation group achieve the best results.（2）NT-3 expresses highest in the OECs and NSCs cell transplantation group.endprint

【Key words】 Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Neurotrophic-3

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.008

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，近年來(lái)其發(fā)病呈逐年增多的趨勢(shì)[1]。如何有效地治療脊髓損傷已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)難題[2]。在治療脊髓損傷眾多方法中，細(xì)胞移植的治療方法越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)采用局部注射法將神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）及嗅鞘細(xì)胞（OECs）分別、共同移植于大鼠脊髓受損區(qū)，通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)（BBB評(píng)分、改良Tarlov評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)）、電生理檢測(cè)（運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位）及免疫組織化學(xué)的方法觀測(cè)各種指標(biāo)，從而考察兩種細(xì)胞移植后在脊髓損傷區(qū)的存活、分化、表達(dá)及功能情況，以期為脊髓損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠購(gòu)買自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共83只，其中3只（出生3 d內(nèi)）用于神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)取材。余80只大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 試劑：DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、兔抗鼠巢蛋白（Nestin）單抗、兔抗鼠P75單抗、兔抗鼠NT-3單抗、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗兔二抗、NT-3染色SP試劑盒等；儀器：5% CO2培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、垂直流潔凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋、玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 （1）神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的培養(yǎng)及鑒定：新生（出生3 d內(nèi)）SD大鼠消毒后，引頸法處死。無(wú)菌條件下，充分暴露出嗅球、兩側(cè)大腦半球及小腦。外科顯微鑷剪斷與海馬有聯(lián)系的大腦皮質(zhì)或神經(jīng)組織，仔細(xì)剝離海馬。垂直流潔凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下將海馬表面的軟腦膜剔除干凈，4 ℃生理鹽水內(nèi)清洗3次后，將海馬放入DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，顯微鏡下用顯微外科剪將其剪碎，巴氏吸管先反復(fù)輕柔機(jī)械吹打分離，不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后離心沉淀，最后將沉淀加入含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d換液1次，每次換50%培養(yǎng)液。傳代一次約需5～7 d。第二代細(xì)胞用特異性Nestin抗原免疫熒光染色法鑒定NSCs。最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109/L，備用。（2）嗅鞘細(xì)胞（OECs）的培養(yǎng)及鑒定：同樣方法，無(wú)菌條件下取大鼠兩側(cè)嗅球后培養(yǎng)OECs。3 d全部換液1次。傳代1次約需16 d。第二代細(xì)胞用P75受體單抗免疫熒光染色法鑒定OECs。最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109個(gè)/L，備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD雄性大鼠（體重200～300 g）80只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（假手術(shù)組）15只、實(shí)驗(yàn)1組（NSCs移植組）20只、實(shí)驗(yàn)2組（OECs移植組）20只和實(shí)驗(yàn)3組（OECs+NSCs聯(lián)合移植組）20只，剩余5只大鼠備用。分組完成后將大鼠做好標(biāo)記。

1.3.3 大鼠急性脊髓損傷Allens模型的制備及術(shù)后一般情況和處理 （1）模型制備：腹腔注射麻醉大鼠起效后，手術(shù)區(qū)備皮，將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒、鋪巾，背部正中切口，鈍性剝離椎旁肌，縫線牽拉開(kāi)，顯露T10～12棘突、橫突及椎板。切除T10棘突及椎板下部、T12棘突及椎板上部和全部T11棘突及椎板，形成方形骨窗，充分暴露相應(yīng)脊髓節(jié)段（T11）的硬脊膜及椎管，作為打擊損傷區(qū)域。自制的改良Allens撞擊器15 g自6 cm高度自由落下，對(duì)T11段脊髓造成損傷，制成急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚3]。打擊完成后，4 ℃生理鹽水沖洗2次，依次逐層常規(guī)縫合切口。（2）術(shù)后一般情況和處理：術(shù)后大鼠禁食水?dāng)?shù)小時(shí)，以后逐漸增加進(jìn)食水量至正常。7 d內(nèi)先單獨(dú)飼養(yǎng)，7 d后5只合籠飼養(yǎng)。術(shù)后7 d內(nèi)青霉素2×105 U肌注2次，預(yù)防傷口、肺部感染，每日飼喂呋喃坦啶水以預(yù)防泌尿系感染。大鼠術(shù)后出現(xiàn)尿潴留，在其恢復(fù)之前，每日應(yīng)給予按摩膀胱協(xié)助排尿3次。

1.3.4 局部注射法行細(xì)胞移植 進(jìn)行細(xì)胞移植之前，先將部分NSCs與OECs混合，用于實(shí)驗(yàn)3組的聯(lián)合細(xì)胞移植。各組細(xì)胞移植均在急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱魍瓿?4 h以內(nèi)進(jìn)行。操作方法：造模成功以后，4 ℃生理鹽水沖洗后，外科顯微鑷輕柔提起T11處硬脊膜，1 mL無(wú)菌注射器針頭在硬脊膜上刺一小洞，垂直進(jìn)針，緩慢向該處硬脊膜下約3 mm、脊髓損傷方向插入，緩慢注入細(xì)胞懸液0.1 mL（細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)）。關(guān)閉切口前，小塊可吸收明膠海綿微加壓填塞于硬脊膜進(jìn)針點(diǎn)處，防止細(xì)胞移植液及大鼠腦脊液的滲漏。對(duì)照組生理鹽水代替細(xì)胞移植液，作陰性對(duì)照，余操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.4 功能檢測(cè)

1.4.1 行為學(xué)評(píng)價(jià) 術(shù)前和術(shù)后1、3、5、7、14、21 d和28 d，隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組15只大鼠及全部對(duì)照組大鼠，采用BBB評(píng)分法、改良的Tralov評(píng)分法和斜板實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能狀況進(jìn)行雙盲法評(píng)分，與手術(shù)之前相比較，以了解受損脊髓功能恢復(fù)情況。

1.4.2 神經(jīng)電生理檢測(cè) 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP N1波）的檢測(cè)，觀察外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)（坐骨神經(jīng)）的功能狀態(tài)。檢測(cè)方法：大鼠麻醉起效后，環(huán)形切開(kāi)頭后部皮膚，剝離至骨膜，細(xì)紋螺釘鉆孔，孔的大小以剛好將刺激電極放入為宜。根據(jù)MEP的產(chǎn)生原理，刺激電極置于皮層，記錄電極置于后肢大腿后側(cè)坐骨神經(jīng)處，參考電極置于硬腭下。刺激類型是：?jiǎn)蚊}沖粗電壓，強(qiáng)度3 V，波寬1 ms、頻率10 Hz，濾波3000 Hz，增益20倍，時(shí)間常數(shù)0.01 s，次數(shù)100次。檢測(cè)完畢后縫合切口。endprint

1.5 大鼠灌注、取材、固定與免疫組織化學(xué)染色 各組隨機(jī)抽取1只大鼠進(jìn)行灌注、取材與固定，免疫組織化學(xué)染色的方法測(cè)定NT-3標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)，檢測(cè)NT-3在局部受損脊髓組織中的表達(dá)情況。操作方法：腹腔麻醉起效后，開(kāi)胸后經(jīng)左心室主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，先快速灌注冰鹽水，清亮液體流出后，再用多聚甲醛經(jīng)心灌注、固定動(dòng)物，速度先快后慢。切取T10～T12脊髓節(jié)段上下各約1 mm脊髓節(jié)段，立即放入中性福爾馬林溶液內(nèi)后固定，再入蔗糖溶液內(nèi)脫水，置4 ℃下至沉底，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為10 um。免疫組織化學(xué)染色按NT-3染色SP試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行（操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。NT-3染色陽(yáng)性的標(biāo)志是細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色。選取15張最優(yōu)切片，每張切片在10倍光鏡下分別計(jì)數(shù)4個(gè)視野內(nèi)染色陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定各組染色陽(yáng)性細(xì)胞在總計(jì)數(shù)細(xì)胞中所占比例（即陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)），重復(fù)5次，求平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評(píng)分變化 對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后24 h內(nèi)BBB評(píng)分均為0分，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況。其中實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)速度及程度大于對(duì)照組（P<0.05）；1周后各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且有增大趨勢(shì)；各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后改良的Tralov評(píng)分變化 所有大鼠模型制備完成后及術(shù)后任一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，Tralov評(píng)分均顯著低于術(shù)前。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況。與BBB評(píng)分的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果相似，實(shí)驗(yàn)組Tralov評(píng)分均顯著高于同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組（P<0.05）；1周后，各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）見(jiàn)表2、圖2。

2.3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板實(shí)驗(yàn)角度變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，大鼠斜板實(shí)驗(yàn)角度大幅下降，術(shù)后1 d由（82.00±3.45）°降為（12.73±1.34）°，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各實(shí)驗(yàn)組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)角度逐漸增加，以術(shù)后第7天增加非常明顯。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后1周以內(nèi)大鼠斜板實(shí)驗(yàn)角度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；1周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

2.4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后MEP（N1波）潛伏期變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長(zhǎng)，但各實(shí)驗(yàn)組N1波潛伏期短于對(duì)照組（P<0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組潛伏期均逐漸縮短，但各實(shí)驗(yàn)組潛伏期縮短幅度大于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組間比較：3 d后，各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

2.5 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后NT-3染色表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，各組大鼠受損脊髓組織中NT-3均有明顯增高，其中術(shù)后第3天達(dá)到高峰，7 d內(nèi)NT-3的表達(dá)維持在較高的水平，此后逐步減少。自術(shù)后第5天（包含5 d）開(kāi)始，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較NT-3增高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表5、圖5。

3 討論

治療急性脊髓損傷必須要明確其受損機(jī)制，從而針對(duì)其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)做出行之有效干預(yù)治療措施。急性脊髓損傷的具體機(jī)制雖尚未被完全闡明，但醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)識(shí)逐漸趨于統(tǒng)一，認(rèn)為脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[4]?；谶@一認(rèn)識(shí)，目前急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)研究中所實(shí)驗(yàn)的新方法新技術(shù)和臨床上治療脊髓損傷的各種常用措施，就是要及早正確的干預(yù)、減輕和預(yù)防可逆性的繼發(fā)性損傷，但取得的治療效果卻不甚理想。上世紀(jì)90年代初，Reynold等[5]在鼠紋狀體中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能、不斷進(jìn)行分裂的細(xì)胞群，后來(lái)Mckay將之命名為神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）。他們的發(fā)現(xiàn)顛覆了人們以往認(rèn)為成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不能夠再生的認(rèn)知，為治療脊髓損傷提供了新的治療思路—細(xì)胞移植。自此，各種細(xì)胞被嘗試用來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和脊髓損傷。在這些嘗試中，最成功的例子就是神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病、癲癇、中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6-9]。但急性脊髓損傷的機(jī)制更加錯(cuò)綜復(fù)雜，細(xì)胞移植雖然在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面取得了重大進(jìn)展與突破，但國(guó)內(nèi)外人體臨床試驗(yàn)尚未大規(guī)模開(kāi)展，這仍有待于研究者的進(jìn)一步地探索研究。

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一類特定的干細(xì)胞，它可以通過(guò)非對(duì)稱分裂的方式分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。此外，還可自分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTF）等物質(zhì)。自其被發(fā)現(xiàn)伊始，神經(jīng)干細(xì)胞就被醫(yī)學(xué)工作者用來(lái)自體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷，這樣不僅可以避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)又解決了移植細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題，取得了滿意的臨床療效，可作為急性脊髓損傷治療的重要參照[10]。

嗅鞘細(xì)胞（OECs）是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可以再生的細(xì)胞之一，被認(rèn)為是髓鞘化能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞，其特點(diǎn)是具備終生再生分裂的能力，它不僅能存活于中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中，而且又可以促進(jìn)外周神經(jīng)元細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)。Sasaki等[11]研究就發(fā)現(xiàn)，嗅鞘細(xì)胞移植后能夠突出脊髓受損區(qū)達(dá)8 mm，除了仍可保持再生分裂的能力外，還可使已經(jīng)脫髓鞘的神經(jīng)元軸突重新髓鞘化。此外，與NSCs相似，嗅鞘細(xì)胞也能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些可能都對(duì)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)起著重要的促進(jìn)作用[12]。endprint

本實(shí)驗(yàn)中，采用單種細(xì)胞或兩種細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠急性脊髓損傷，將能夠分泌NT-3的神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞分別、共同移植于脊髓受損區(qū)，以期可持續(xù)分泌NT-3，這樣就可避免外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子半衰期短和持續(xù)性作用差的弊端，等同于NT-3、神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞共同修復(fù)受損的脊髓，改善大鼠急性脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[13]。實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到，造模及細(xì)胞移植術(shù)后，24 h內(nèi)各組大鼠BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分均為0分，斜板實(shí)驗(yàn)角度下降非常明顯，由實(shí)驗(yàn)前的（82±3.45）°降為（12.73±1.34）°，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長(zhǎng)。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況，各實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分與對(duì)照組相比增高顯著（P<0.05）；斜板實(shí)驗(yàn)角度也逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組增幅要大于對(duì)照組，以術(shù)后第7天增加非常明顯；各組MEP（N1波）潛伏期均逐漸縮短，且各實(shí)驗(yàn)組潛伏期縮短幅度大于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明大鼠急性脊髓損傷后有一定的自我恢復(fù)作用，細(xì)胞移植能夠?qū)κ軗p脊髓產(chǎn)生修復(fù)治療效應(yīng)，促進(jìn)大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)動(dòng)能恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)3組BBB評(píng)分和改良的Tralov評(píng)分在各實(shí)驗(yàn)組中增高最顯著，實(shí)驗(yàn)2組次之，實(shí)驗(yàn)1組最弱，表明細(xì)胞移植雖能促進(jìn)大鼠傷后后肢運(yùn)動(dòng)動(dòng)能的恢復(fù)，但單種細(xì)胞移植或兩種細(xì)胞聯(lián)合移植后取得的治療效果不甚相同。筆者還觀察到，急性脊髓損傷后NT-3表達(dá)量迅速增高，術(shù)后第3天達(dá)到最高峰，7 d內(nèi)其濃度維持在一個(gè)較高的水平，此后表達(dá)明顯變?nèi)酰呌谄骄?。這說(shuō)明，大鼠急性脊髓損傷后機(jī)體本身NT-3合成增加，推測(cè)NT-3可能在急性脊髓損傷的早期修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)3組和實(shí)驗(yàn)2組與實(shí)驗(yàn)1組相比促進(jìn)作用更顯著（P<0.05），實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明，OECs+NSCs聯(lián)合移植促進(jìn)NT-3分泌的作用最優(yōu)，OECs移植次之，NSCs移植最弱。這與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

然而，并非所有的實(shí)驗(yàn)研究都獲得了一致或相仿的研究結(jié)論。有學(xué)者認(rèn)為，局部注射法進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)，“細(xì)胞遷徙”可能是人為進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)局部注射的壓力所導(dǎo)致的局部擴(kuò)散而已，而不是所謂的“主動(dòng)遷徙”[14]。在各種急性脊髓損傷模型中，如脊髓半或全橫斷模型，脊髓壓迫模型等，可見(jiàn)細(xì)胞移植無(wú)療效或療效甚微的案例，故而一部分學(xué)者對(duì)細(xì)胞移植治療急性脊髓損傷的療效抱有懷疑態(tài)度[15]。盡管如此，筆者認(rèn)為急性脊髓損傷機(jī)制的復(fù)雜性決定了其治療的全面性，不是單獨(dú)應(yīng)用一種治療方法或多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用就可一蹴而就的。細(xì)胞移植的方法雖然不是涉及了急性脊髓損傷修復(fù)的所有方面，但取得了一定的療效。

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（收稿日期：2014-05-14） （本文編輯：蔡元元）endprint

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