劉海英，劉丹莉，高順利

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，湖南衡陽(yáng) 421001）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由柯薩奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）等嗜心肌病毒引起的心肌炎癥性疾病，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。眾多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞因子在VMC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。白細(xì)胞介素－17（interleukin－17，IL－17）是一種由 Th17細(xì)胞分泌的前炎癥細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)IL－6和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的促炎作用［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL－17有助于VMC與自身免疫性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展［3－4］。黃芪甲甙是從中藥黃芪中提取的一單體成分，對(duì)VMC有較好的治療效果［5］，然而，其抗VMC機(jī)制仍未完全闡明。為此，本研究通過(guò)CVB3感染Balb／c小鼠建立VMC動(dòng)物模型，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組化觀察IL－17在VMC小鼠心肌組織中的表達(dá)情況，并以黃芪甲甙進(jìn)行干預(yù)研究，從而探索IL－17在VMC

發(fā)病機(jī)制中的作用及黃芪甲甙的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 本實(shí)驗(yàn)使用CVB3為Nancy株，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，在Hela細(xì)胞中進(jìn)行傳代，然后離心，提取上清液，并檢測(cè)50% 組織感染率（TCID50），TCID50為107，保存于－70℃冰箱備用，實(shí)驗(yàn)所用病毒劑量為1×102TCID50。

1.1.2 動(dòng)物 Balb／c小鼠60只，4周齡，雄性，純種，體質(zhì)量12～16g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體2000B017（SPF）條件下。

1.1.3 藥物 黃芪甲甙粉劑（批號(hào)：0781－9706）購(gòu)買于國(guó)家藥物和生物制品檢定研究所（NICPBP），不溶于水，用助溶劑羧甲基纖維素鈉制成均勻懸液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將濃度設(shè)置為0.01、0.09g／L。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、模型制備及藥物干預(yù) 60只Balb／c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組、模型組、低劑量干預(yù)組以及高劑量干預(yù)組，每組15只。對(duì)照組小鼠僅腹腔注射0.1mL不含CVB3的病毒培養(yǎng)液，其余3組小鼠腹腔接種0.1mL內(nèi)含1×102TCID50CVB3的病毒液，以誘發(fā)VMC，對(duì)照組和模型組于接種當(dāng)日即用0.1mL羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，低劑量干預(yù)組和高劑量干預(yù)組分別以0.01、0.09g／L黃芪甲甙0.1 mL灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)14d，并記錄各組小鼠一般狀況及每天存活數(shù)。第15天稱體質(zhì)量（BW）后斷頸處死小鼠，摘取心臟，稱心臟質(zhì)量（HW），計(jì)算HW／BW，然后將小鼠心臟沿左心室中線切為兩部分，一部分用甲醛固定、石碏包埋，用HE染色和免疫組化檢測(cè)；另一部分迅速置于液氮中，再轉(zhuǎn)移至－70℃冰箱凍存，用于總RNA的提取與ELISA檢測(cè)。

1.2.2 HE染色 按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，在200倍光鏡下分析小鼠心肌病理學(xué)變化，參照文獻(xiàn)［6］計(jì)算心肌病變（炎癥浸潤(rùn)或壞死）積分：每張心肌切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野面積比值，0分表示無(wú)病理學(xué)改變，1分表示心肌病變面積小于25%，2分表示心肌病變面積為25%～50%，3分表示心肌病變面積大于50%～75%，4分表示心肌病變面積大于75%。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 采用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取小鼠心肌組織總RNA，溶于無(wú)Rnase水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260／OD280的比值為1.8～2.0。取總RNA 2μg，用Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照文獻(xiàn)［7］由上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物序列。IL－17上游引物：5′－GTC AAT GCG GAG GGA AAG－3′，下游引物：5′－CAC GAA GCA GTT TGG GAC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度349bp；β－actin上游引物：5′－CCA GCC TTC CTT CTT GGG TAT－3′，下游引物：5′－TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度102bp。取10μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸45s，總共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。溶解曲線分析表明PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法，以β－actin表達(dá)為內(nèi)參定量IL－17的表達(dá)。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 將心肌組織放入液氮碾磨，三去污裂解液裂解。利用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒（Hyclone－Pierce公司）檢測(cè)蛋白水平，50μg蛋白與加樣緩沖液混合，在10%不連續(xù)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳膠中電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，孵育一抗（美國(guó)Santa Cruz公司）、二抗，以β－actin為內(nèi)參照，用ECL發(fā)光法顯色，曝光、顯影、定影。膠片條帶用薄層掃描儀進(jìn)行掃描后，運(yùn)用Imager2200軟件分析各產(chǎn)物積分光密度值，計(jì)算IL－17蛋白表達(dá)水平。IL－17蛋白表達(dá)水平＝IL－17積分光密度值／β－actin積分光密度值。

1.2.5 ELISA檢測(cè) 通過(guò)苯甲磺?；铮≒MSF）將心肌組織勻漿，然后離心，提取上清液，利用ELISA試劑盒（深圳晶美生物工程公司）檢測(cè)上清液中IL－6、TNF－α水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書由專人進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組均數(shù)比較行單因素方差分析及兩兩之間比較的q檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪甲甙對(duì)小鼠死亡率與HW／BW的影響 在實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組無(wú)小鼠死亡，模型組死亡率為46.67%（7／15），低劑量干預(yù)組死亡率為33.33%（5／15），高劑量干預(yù)組死亡率為20.00%（3／15）；高劑量干預(yù)組死亡率較模型組降低（P＜0.05），但低劑量干預(yù)組死亡率與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，模型組 HW／BW 明顯增加（P＜0.01）；經(jīng)黃芪甲甙處理后，高劑量干預(yù)組HW／BW較模型組降低（P＜0.05），然而低劑量黃芪甲甙對(duì)HW／BW無(wú)影響（P＞0.05），見表1。

2.2 黃芪甲甙對(duì)心肌病理組織學(xué)變化的影響 對(duì)照組心肌呈規(guī)則排列，未見到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞壞死；模型組出現(xiàn)大片心肌細(xì)胞壞死，周圍可見眾多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量干預(yù)組心肌病變程度與模型組相似；高劑量干預(yù)組壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。與模型組比較，高劑量干預(yù)組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與心肌壞死積分顯著降低（P＜0.01）；而低劑量干預(yù)組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表1。

圖1 各組心肌病理學(xué)改變（×200）

表1 各組死亡率、HW／BW及病理積分比較

2.3 黃芪甲甙對(duì)心肌IL－17mRNA表達(dá)的影響 條帶密度掃描及半定量分析顯示，模型組心肌組織中IL－17mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，經(jīng)過(guò)高劑量黃芪甲甙處理后，其表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；低劑量干預(yù)組IL－17mRNA表達(dá)水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.4 黃芪甲甙對(duì)心肌IL－17蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示，模型組IL－17蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，經(jīng)過(guò)高劑量黃芪甲甙處理后，IL－17蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），但低劑量黃芪甲甙對(duì)其無(wú)明顯影響（P＞0.05），見圖3。

圖2 各組小鼠心肌IL－17mRNA表達(dá)比較

圖3 各組小鼠心肌IL－17蛋白表達(dá)比較

2.5 黃芪甲甙對(duì)心肌組織IL－6、TNF－α水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組心肌組織中IL－6、TNF－α水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；經(jīng)高劑量黃芪甲甙處理后，IL－6、TNF－α水平較模型組明顯降低（P＜0.05），但低劑量黃芪甲甙對(duì)上述指標(biāo)無(wú)影響（P＞0.05），見圖4、5。

圖4 各組小鼠心肌IL－6水平比較

圖5 各組小鼠心肌TNF－α水平比較

3 討 論

IL－17是Th17細(xì)胞分泌的特征性因子，由155個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為3×103，N端為19～23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)多肽，其基因定位于染色體2q31。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL－17是一種強(qiáng)大的前炎癥因子，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的發(fā)育和成熟，并能刺激T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞分泌多種炎癥介質(zhì)，如IL－1、IL－6、IL－8、TNF－α、一氧化氮合酶2、單核細(xì)胞趨化蛋白－1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子α、金屬蛋白酶及化學(xué)增活素等，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［8］。Yuan等［9］報(bào)道，Th17細(xì)胞及血清IL－17水平在急性VMC患者中升高。Chang等［10］在心肌肌球蛋白誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎中發(fā)現(xiàn)，心臟組織中IL－17、IL－17受體、IL－23表達(dá)均增加，其中以IL－17增加最為明顯。有研究表明，IL－17在VMC小鼠心肌組織中表達(dá)顯著升高，并且與心肌病變程度呈正相關(guān)［7］。本研究結(jié)果顯示，在正常小鼠心肌組織中存在低水平的IL－17表達(dá)，當(dāng)小鼠感染CVB3后，IL－17的表達(dá)量顯著升高，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，表明在生理?xiàng)l件下組成性表達(dá)的IL－17可能參與維持心臟結(jié)構(gòu)與功能的平衡，而CVB3感染所致的IL－17過(guò)表達(dá)可能與VMC的發(fā)生、進(jìn)發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制IL－17的表達(dá)及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能成為治療VMC的一個(gè)潛在的、有價(jià)值的靶點(diǎn)。

黃芪為一傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌、益氣理虛、伏正固本之功效。黃芪甲甙是黃芪注射液中的主要有效成分，它是一種黃芪皂甙類單體成分。眾多實(shí)驗(yàn)不但發(fā)現(xiàn)其對(duì)實(shí)驗(yàn)性VMC動(dòng)物模型療效較好，而且已初步闡明其機(jī)制：抗病毒作用；抗心肌細(xì)胞凋亡作用［11］；下調(diào)心肌柯薩奇－腺病毒受體表達(dá)，從而減少CVB3對(duì)心肌細(xì)胞的親和力［12］；抑制心肌細(xì)胞L型鈣通道電流及鈣超載［10］。然而，這種藥物抗VMC的機(jī)制仍未完全闡明。本研究中，VMC小鼠給予高劑量黃芪甲甙干預(yù)治療后，小鼠死亡率、HW／BW、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與心肌壞死病理積分降低，IL－17mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而低劑量黃芪甲甙干預(yù)治療則無(wú)此作用，提示黃芪甲甙對(duì)VMC有良好的治療作用，其機(jī)制可能與抑制IL－17表達(dá)有關(guān)。

炎癥因子IL－6、TNF－α過(guò)表達(dá)在VMC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。已有研究證實(shí)IL－17能促進(jìn)IL－6、TNF－α分泌。Yang等［13］報(bào)道，腹腔注射IL－17單克隆抗體阻斷IL－17的作用，可以明顯改善VMC小鼠心肌病變程度，并下調(diào)心肌組織中IL－6、TNF－α的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步探討黃芪甲甙治療VMC的機(jī)制，作者通過(guò)ELISA檢測(cè)了心肌組織IL－6、TNF－α水平，發(fā)現(xiàn)模型組心肌組織中IL－6、TNF－α水平顯著高于對(duì)照組，經(jīng)高劑量黃芪甲甙處理后，IL－6、TNF－α水平較模型組明顯降低，提示黃芪甲甙對(duì)VMC的治療作用可能與其抑制IL－17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明IL－17在VMC小鼠心肌組織中表達(dá)升高，提示IL－17可能參與了VMC的發(fā)病過(guò)程，黃芪甲甙對(duì)VMC治療作用較好，這種作用可能與其抑制IL－17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，可為黃芪甲甙的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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