王延平，陳旭勤△，王浙東，張兵兵，傅豐慶，李 巖▲

（1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇蘇州 215003；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所，江蘇蘇州 215004）

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumococcal，SP）是引起化膿性腦膜炎最常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌之一［1］。在能引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，SP腦膜炎是最復(fù)雜，最嚴(yán)重的［2］。通過(guò)正規(guī)的抗菌藥物、激素及支持治療后，SP腦膜炎仍有高達(dá)25%的致死率，約50%的存活者遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［2］，多表現(xiàn)為智力低下、驚厥發(fā)作、聽(tīng)力損害、感覺(jué)障礙和運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后等［3］。因此，進(jìn)一步研究細(xì)菌性腦膜炎的免疫病理機(jī)制，對(duì)治療和改善細(xì)菌性腦膜炎預(yù)后意義重大。B7同源體3（B7H3）是B7協(xié)同刺激分子家族的新成員，它不僅在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)控中扮演者多種角色而且與SP腦膜炎的固有免疫應(yīng)答有關(guān)［4］。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是反映腦損傷的標(biāo)志物［5］，S100b蛋白約96%存在于腦內(nèi)，絕大部分分布于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，是反映腦組織損傷的標(biāo)志蛋白［6］。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，在確診細(xì)菌性腦膜炎患者的腦脊液中，B7H3的表達(dá)顯著升高［7］，并且在小鼠SP腦膜炎中，證實(shí)了B7H3是通過(guò)TLR－2機(jī)制增強(qiáng)了腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，并且加劇了血腦屏障的破壞［4］。本研究是在既往實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察B7H3對(duì)SP腦膜炎小鼠的臨床癥狀以及檢測(cè)腦損傷標(biāo)志物NSE和S100b的基因表達(dá)的作用，進(jìn)一步分析B7H3對(duì)SP腦膜炎中腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB／C小鼠共48只，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（斯克萊公司）提供。試劑：SP3型購(gòu)自American Tissue Cell Culture Collection（ATCC，Manassas，VA），菌號(hào)：ATCC 6303；mB7H3蛋白購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；NSE、S100b和β－action三對(duì)引物均由上海博亞（英駿）有限公司設(shè)計(jì)；Trizol試劑購(gòu)自上海博亞（英駿）有限公司；Prime Script RT reagent kit Perfect Real Time試劑盒、SYBR Premix Ex TaqII（Perfect Real Time）試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNeasy?Mini Kit購(gòu)自凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將48只BALB／C小鼠分為4組，每組12只。生理鹽水組（CON組）定位后向側(cè)腦室注入15μL 0.9%氯化鈉，B7H3蛋白組（B7H3組）定位后向側(cè)腦室注入10μL濃度為0.33μg／μL的B7H3蛋白＋5μL 0.9%氯化鈉，SP組定位后向側(cè)腦室注入10μL 0.9%氯化鈉＋5μL濃度為1.5×104cfu／mL），SP＋B7H3組。以上各實(shí)驗(yàn)組小鼠按處死時(shí)間分為18h組、48h組、72h組，術(shù)后置于室溫20～25℃，光線明、暗各12h，自由飲食飼養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌與化膿性腦膜炎的制備 將菌種ATCC 6303接種于血瓊脂糖固體培養(yǎng)基上，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落，接種于含有15mL腦心浸液的50mL的離心管中，傾斜插入37℃恒溫?fù)u床中，以240r／min振速搖過(guò)夜；取350μL細(xì)菌懸液接種于腦心浸液中，240r／min 37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)6～8h，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收菌，3 000r／min離心20min，離心后在管底可見(jiàn)乳白色沉淀，棄上清液，取10mL無(wú)菌的PBS沖洗細(xì)菌沉淀；再同前離心1次，棄上清液后用無(wú)菌PBS 10mL重懸沉淀，充分吹打混勻后，取100μL，仍用無(wú)菌PBS進(jìn)行倍比稀釋余下細(xì)菌離心，將只含有細(xì)菌沉淀的離心管用封口膜封住放入－20℃冰箱中備用；倍比稀釋后的細(xì)菌各取100μL進(jìn)行涂板，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后計(jì)數(shù)血平板上的菌落，計(jì)算保存?zhèn)溆玫募?xì)菌總數(shù)。在制作化膿性腦膜炎時(shí)，用0.9%氯化鈉稀釋備用細(xì)菌沉淀，制成濃度為1.5×104cfu／mL的SP懸液。

小鼠腦膜炎模型采用改進(jìn)的Diab的側(cè)腦室注射法［8］，首先用麻醉劑戊巴比妥鈉（濃度1.0%）60mg／kg，腹腔注射誘導(dǎo)深度麻醉，然后俯臥位固定小鼠，在小鼠頭正中沿矢狀位做一個(gè)長(zhǎng)1.5cm左右的切口，暴露顱骨結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)各額、頂骨結(jié)構(gòu)界限，準(zhǔn)確定位：前囟后約0.5mm，中線右旁開(kāi)1.0mm為進(jìn)針處，垂直深度為2.5～3.0mm，然后將15μL的細(xì)菌懸液（1.5×104cfu／mL）在約2min內(nèi)緩慢、勻速地注入側(cè)腦室，留置針頭于顱內(nèi)1min后緩慢拔出（控制好注入速度和退針?biāo)俣?，以防由于速度過(guò)快引起的顱內(nèi)壓急劇升高和退針過(guò)快注入的液體外溢而影響注入側(cè)腦室的液體量）。為證實(shí)定位準(zhǔn)確，按以上定位方法向側(cè)腦室內(nèi)注射藍(lán)黑墨水，3～5min后頸椎脫臼處死，解剖腦部結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)藍(lán)黑色墨水已通過(guò)腦脊液迅速擴(kuò)散至脊髓腔顱底窩小腦延髓池雙側(cè)側(cè)腦室。

1.2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在18、48、72h時(shí)分別對(duì)各組小鼠（n＝4）進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Loeffler的神經(jīng)行為學(xué)5分制評(píng)分方法［9］。5分：抓住背部時(shí)能正?；顒?dòng)，在5s內(nèi)翻身成功；4分：自主運(yùn)動(dòng)減少，5s內(nèi)能翻身；3分：翻身可以成功，但時(shí)間超過(guò)5s；2分：不能翻身；1分：不能運(yùn)動(dòng)；0分：死亡。

1.2.4 實(shí)時(shí)－PCR 側(cè)腦室注射后18、48、72h，將各組小鼠（n＝4）用1%戊巴比妥鈉（60mg／kg）腹腔注射麻醉，快速頸椎脫臼處死，在冰塊上斷頭，將腦組織迅速放入液氮中快速凍。待行實(shí)時(shí)－PCR檢測(cè)。采用TRIZOL抽提法提取小鼠腦組織勻漿中的總RNA，抽提的總RNA，使用RNeasy?Mini Kit進(jìn)行純化，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取純化后的RNA 500ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄操作步驟按照Prime Script RT reagent kit Perfect Real Time執(zhí)行，逆轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃15min，85℃5s。特異性引物如下：NSE上游引物5′－TCA TTC TCC TGG AGC CTC TT－3′，下 游 引 物 5′－AAG AGC AGA GAG AGC AAG G－G－3′；S100b上游引物5′－TGC CCT CAT TGA TGT CTT CCA－3′，下游引物5′－GAG AGA GCT CGT TGT TGA TAA GCT－3′；β－actin上游引物，5′－GGT CAT CAC TAT TGG CAA CG－3′，下 游 引 物 5′－ACG GAT GTC AAC GTC ACA CT－3′。實(shí)時(shí)－PCR的操作按照SYBR Premix Ex TaqII（Perfect Real Time）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95℃30s1個(gè)循環(huán)，95℃5s，60℃30s，72℃30s35個(gè)循環(huán)，72℃15min 1個(gè)循環(huán)。

1.2.5 NSE、S100bmRNA的相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算 采用2－ΔΔct方法計(jì)算mRNA的相對(duì)量，以β－actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)NSE、S100bmRNA進(jìn)行均一化處理，利用熒光閾值（Ct值）計(jì)算NSE、S100bmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以s表示，數(shù)據(jù)作正態(tài)性W 檢驗(yàn)和方差齊性Levene檢驗(yàn)；滿足條件者多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)；不滿足條件者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 B7H3對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 各時(shí)點(diǎn)B7H3組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與CON組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同時(shí)間點(diǎn)SP組較 CON組降低（P＜0.05）；SP＋B7H3組與SP組比較，評(píng)分進(jìn)一步降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為評(píng)分比較（s）

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為評(píng)分比較（s）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 5.000±0.000a5.000±0.000a5.000±0.000組別 n a B7H3組 4 5.000±0.000a5.000±0.000a5.000±0.000a SP組 4 4.500±0.577b 3.500±0.577b 2.750±0.500b SP＋B7H3組4 4.000±0.000 3.000±0.000 1.750±0.500

2.2 實(shí)時(shí)－PCR特異性產(chǎn)物 實(shí)時(shí)－PCR產(chǎn)物具有高度特異性，電泳條帶如圖2。

圖2 實(shí)時(shí)－PCR特異性產(chǎn)物

2.3 B7H3對(duì)腦膜炎時(shí)腦損傷標(biāo)志物NSE、S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 在細(xì)菌注射后18、48、72h，B7H3組與CON組比較，NSE、S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同時(shí)間點(diǎn)SP組NSE、S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組明顯升高（P＜0.05）；各時(shí)間點(diǎn)SP＋B7H3組NSE、S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量較SP組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

表2 4組小鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織NSE mRNA水平比較（）

表2 4組小鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織NSE mRNA水平比較（）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 0.028±0.006a0.028±0.003a0.028±0.001組別 n a B7H3組 4 0.052±0.034 0.020±0.001 0.036±0.002 SP組 4 0.095±0.030b 0.177±0.021b 0.369±0.035b SP＋B7H3組4 0.124±0.049 0.330±0.088 0.529±0.020

表3 4組小鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織S100bmRNA水平比較s）

表3 4組小鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織S100bmRNA水平比較s）

a：P＜0.05，與SP組比較；b：P＜0.05，與SP＋B7H3組比較。

18h 48h 72h CON組 4 0.032±0.006a0.029±0.002a0.046±0.002組別 n a B7H3組 4 0.040±0.018 0.029±0.003 0.048±0.001 SP組 4 0.061±0.057b 0.185±0.012b 0.284±0.008b SP＋B7H3組4 0.148±0.052 0.194±0.018 1.620±0.118

3 討 論

B7H3是B7協(xié)同刺激分子家族的新成員，作者的臨床資料表明，在確診細(xì)菌性腦膜炎患者的腦脊液中，相對(duì)于病毒性腦炎患兒可溶性B7H3的表達(dá)顯著升高［7］，推測(cè)B7H3蛋白在細(xì)菌性腦膜炎的病理、生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，通過(guò)側(cè)腦室注射SP懸液建立SP腦膜炎小鼠模型，并且選取術(shù)后18、48、72h時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察腦膜炎的癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)在側(cè)腦室注射后18h，SP組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較CON組降低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組小鼠在細(xì)菌感染后18h就已經(jīng)出現(xiàn)了腦膜炎臨床癥狀；在細(xì)菌注射后48、72h時(shí)，SP組與CON組比較評(píng)分呈下降趨勢(shì)，表明隨著時(shí)間的推移腦膜炎小鼠的病情逐步加重。SP和B7H3蛋白的聯(lián)合注射與SP單獨(dú)注射相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分進(jìn)一步下降，表明在SP感染的前提下B7H3加劇了SP腦膜炎的病情進(jìn)展。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)B7H3蛋白單獨(dú)注射小鼠的神經(jīng)行為評(píng)分在各時(shí)間點(diǎn)均較CON組無(wú)變化，表明B7H3蛋白本身對(duì)正常小鼠無(wú)影響，這與作者最近的研究結(jié)果相符［4］。

除臨床癥狀外，本研究中還運(yùn)用了實(shí)時(shí)－PCR技術(shù)檢測(cè)腦組織勻漿中腦損傷標(biāo)志物NSE、S100bmRNA的表達(dá)。NSE是一種細(xì)胞質(zhì)中的糖酵解酶，是存在于神經(jīng)元內(nèi)的形式，它是由γγ二聚體組成的，相對(duì)分子質(zhì)量為78×103，半衰期為24 h［10］，它特異性存在于神經(jīng)元尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元內(nèi)，當(dāng)神經(jīng)元遭受各種應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)將其釋放［11］。有研究表明，NSE血清水平亦越高，腦損傷的程度越重［12］。S100b蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量只有21×103的鈣結(jié)合蛋白，生物半衰期為2h，它是由ββ組成的同源二聚體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)并由它分泌［13］。當(dāng)S100b水平異常升高時(shí)，它可以通過(guò)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加而產(chǎn)生有害影響促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。亦有研究表明，S100bmRNA在成年和老年小鼠的創(chuàng)傷性腦損傷中的表達(dá)是上調(diào)的［15］。在本研究中，實(shí)時(shí)－PCR結(jié)果顯示，細(xì)菌接種后18、48、72h，SP組小鼠 NSE、S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組明顯升高，表明在基因水平，SP感染誘導(dǎo)了小鼠腦組織中NSE、S100b的表達(dá)，SP＋B7H3組小鼠的S100bmRNA相對(duì)表達(dá)量較SP組更進(jìn)一步升高，而在S100b、NSE mRNA結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)B7H3組和CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)合SP腦膜炎小鼠的同步的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的動(dòng)態(tài)觀察，本結(jié)果顯示，在腦膜炎的病情進(jìn)展中，B7H3在SP感染的基礎(chǔ)上上調(diào)了SP腦膜炎小鼠腦損傷標(biāo)志物NSE、S100b基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在SP腦膜炎小鼠中，B7H3蛋白干預(yù)加劇了SP腦膜炎的臨床癥狀，并且對(duì)腦損傷標(biāo)志物NSE、S100b的基因表達(dá)發(fā)揮了上調(diào)作用。因此，可以認(rèn)為協(xié)同刺激分子B7H3在細(xì)菌性腦膜炎引起的腦損傷可能發(fā)揮著積極作用。這一研究結(jié)論為B7H3作為細(xì)菌性腦膜炎干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。深入探討B(tài)7H3加劇SP腦膜炎腦損傷的信號(hào)機(jī)制，正是作者后續(xù)研究中的主要內(nèi)容。

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