支力強，馬 巍△，王維華，王小平

（1.西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科，西安 710061；2.西安交通大學醫(yī)學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計教研室，西安 710061；3.陜西中醫(yī)學院分子病理學研究室，西安 712046）

骨肉瘤作為最常見的惡性成骨性腫瘤之一，高發(fā)于10～14歲的青少年，發(fā)病率在原發(fā)的兒童和青少年性惡性骨腫瘤中排第1位。具有高轉(zhuǎn)移活性，惡性程度極高，主要通過血行轉(zhuǎn)移到其他組織和器官。以往研究顯示，腎上腺髓質(zhì)素（ADM）和整合素αvβ3在腫瘤中表達異常，且其表達的強度與腫瘤惡性程度有關(guān)，表明二者與腫瘤的惡性生物學行為有密切聯(lián)系［1－2］。而在人骨肉瘤中同時檢測ADM和整合素αvβ3的表達，并分析二者與骨肉瘤臨床病理因素之間關(guān)系的研究在國內(nèi)外少見報道。為了闡述二者關(guān)系，對本院30例骨肉瘤患者腫瘤組織的石蠟標本中ADM和整合素αvβ3的水平進行了檢測，并探討二者之間的相關(guān)性及對骨肉瘤患者治療和預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取西安交通大學醫(yī)學院第一、二附屬醫(yī)院自2006年6月至2013年6月經(jīng)臨床、病理、X線片確診為骨肉瘤的患者30例，入院時所有患者均未接受正規(guī)化療，為準確診斷，所有患者的活檢檢查均于放化療之前進行。以2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（ACJJ）對于骨肉瘤GTM分期法為標準對病例進行分期［3］，因GTM分期對于腫瘤分級（G）的判定沒有明確的評判標準，故參考聯(lián)邦法國癌癥中心（FNCLCC）關(guān)于骨與關(guān)節(jié)腫瘤分級方法中骨腫瘤分級（G）的標準作為ACJJ法中分級（G）的補充，即按：Gx、G1＝1級，G2＝2級，G3、4＝3級［4］。再以Dahlin′s組織學分型為骨肉瘤的分型標準。其中男18例，女12例；年齡8～47歲，平均（18.42±9.10歲）。股骨下段腫瘤13例，脛骨上段10例，其他部位7例。就診時未發(fā)生轉(zhuǎn)移者28例，已發(fā)生轉(zhuǎn)移者2例；其中Ⅱa期6例，Ⅱb期11例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例。骨母細胞型15例，軟骨母細胞型5例，纖維母細胞型2例，其他類型8例。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組化SABC法和圖像分析技術(shù)的方法檢測30例骨肉瘤組織中ADM和整合素αvβ3的陽性率、表達強度和平均光密度（ALD）。所有骨肉瘤標本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋后，行4mm厚連續(xù)切片。先從各組中取一張行HE染色確認診斷后，其余切片再行免疫組化法檢測。使用的兩種抗體分別為：兔抗人ADM單克隆抗體（稀釋度為1∶250，ABCAM公司）、鼠抗人整合素αvβ3單克隆抗體（稀釋度為1∶300，ABCAM公司）。SABC免疫組化試劑盒及其他試劑均購于北京中杉公司。操作步驟按試劑盒說明書進行檢測，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為空白對照。

1.3 判定標準 每張切片分別由兩名病理醫(yī)師在未知臨床和病理資料的情況下獨立觀察切片，隨機觀察（至少5個具有代表性的高倍視野，計數(shù)100個細胞），判定腫瘤分期、分級及細胞染色程度。根據(jù)染色程度及染色細胞百分率進行分析評分：（1）基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；（2）著色細胞占計數(shù)細胞百分率，≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分。再將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相加，為其最后得分：0～1分為陰性（－）；＞1～4分弱陽性（＋）；＞4～6分中陽性（＋＋）；＞6分為強陽性（＋＋＋）。在每張切片的高倍視野（×400）下隨機選取5個不同視野，將所見視野輸入計算機，經(jīng)全自動醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)析處理，得到5個視野的ADM與整合素αvβ3的ALD。ALD值越大，說明目的蛋白的表達水平越高。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有的統(tǒng)計分析采用SPSS18.0進行處理，計量資料以表示，計數(shù)資料以頻數(shù)及百分率表示。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行q檢驗，計數(shù)資料多組間用χ2檢驗進行分析，ADM與整合素αvβ3的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。檢驗水準＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADM和整合素αvβ3表達的陽性率 ADM和整合素αvβ3表達的陽性率與骨肉瘤患者的性別、年齡、原發(fā)部位、FNCLCC腫瘤分級、GTM分期及Dahlin′s組織學分型之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與腫瘤的體積大小、腫瘤是否轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 ADM和整合素αvβ3在骨肉瘤組織中的表達 鏡下觀察ADM與整合素αvβ3的陽性染色均呈棕黃色或棕褐色，二者染色主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)。ADM和整合素αvβ3的表達強弱與骨肉瘤不同分期之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其表達強度隨著骨肉瘤分期的上升而逐漸增加。見圖1、2，表2、3。

表1 骨肉瘤患者一般資料（n）

表2 ADM表達強度與骨肉瘤分期的關(guān)系

表3 整合素αvβ3表達強度與骨肉瘤分期的關(guān)系

圖1 ADM在不同分期骨肉瘤中的表達情況（SABC法，×200）

圖2 整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤中的表達情況（SABC法，×200）

2.3 ADM和整合素αvβ3在骨肉瘤組織中ALD的表達 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其ALD數(shù)值也隨著腫瘤分期上升而逐漸增高，且在不同分期之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 ADM與整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤組織中ALD表達（s）

表4 ADM與整合素αvβ3在不同分期骨肉瘤組織中ALD表達（s）

分期 n ADM 整合素αvβ3Ⅱa期6 0.038 13±0.014 45 0.031 12±0.015 32Ⅱb期 11 0.060 21±0.012 68 0.047 58±0.016 22Ⅲ 期 11 0.078 91±0.024 38 0.062 35±0.025 78Ⅳ 期2 0.096 02±0.032 01 0.086 09±0.021 90

2.4 ADM與整合素αvβ3表達的相關(guān)性 應(yīng)用Spearman直線相關(guān)法計算兩者在不同分期骨肉瘤組織中表達的相關(guān)性，求得相關(guān)系數(shù)為r＝0.817，P＜0.01。二者的表達變化水平呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

3.1 骨肉瘤的分期標準 骨與軟組織肉瘤的種類繁多，治療方式也與其病理類型密切相關(guān)，但真正影響治療決策的則是肉瘤分期，它直接決定了是否應(yīng)該進行放化療或手術(shù)。Enneking臨床分期法雖然可以對骨肉瘤做出大概的分期，主要是用來評估患者群體的治療效果，但對每個患者制訂手術(shù)治療方案的幫助并不大［5］。而2010年制定的AJCC分期系統(tǒng)是依據(jù)腫瘤的組織學分級（G）、腫瘤大小（T）、淋巴結(jié)狀態(tài)（N）和有無遠處轉(zhuǎn)移（M）進行分期的。其中，后三者的評判標準都非常明確，但對于組織學分級的標準仍存在爭議［6－8］。而FNCLCC分級法則是依據(jù)腫瘤的分化程度、有絲分裂計數(shù)和腫瘤壞死程度對腫瘤進行量化地分級評定，是對AJCC法分級標準的量化和補充。本實驗將兩種標準結(jié)合在一起使用，可以從宏觀和微觀的角度判斷骨肉瘤的分級和分期，有助于制定下一步的個體化治療方案。

3.2 ADM和整合素αvβ3與骨肉瘤的關(guān)系 侵襲和轉(zhuǎn)移是骨肉瘤重要的惡性生物學行為之一，是一個極其復(fù)雜的過程，主要包括：原發(fā)癌腫瘤細胞的大量增殖、腫瘤血管生成、瘤細胞脫落并侵入基質(zhì)、進入脈管系統(tǒng)和瘤細胞在轉(zhuǎn)移組織、器官上的定位生長。這其中每一步都包含著多種細胞因子及多種細胞信號傳導(dǎo)通路的復(fù)雜調(diào)節(jié)作用。ADM可作為循環(huán)激素、旁分泌激素及自分泌激素參與體內(nèi)多種生理、病理過程［9］。且在多種腫瘤中高表達，表現(xiàn)出強大的抑制腫瘤細胞凋亡和參與新生血管形成的能力，能夠促進腫瘤細胞增殖和血管生成，緩解腫瘤內(nèi)部相對缺氧的環(huán)境，有利于腫瘤的局部浸潤和轉(zhuǎn)移［10］。前期研究也發(fā)現(xiàn)，ADM在骨肉瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織，且在患者血漿中的水平也明顯高于健康人，尤其是轉(zhuǎn)移組的血漿水平更是遠高于未轉(zhuǎn)移組［11］。后來又發(fā)現(xiàn)ADM可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達而參與新生血管的生成，促進腫瘤發(fā)展，且沉默ADM基因后，VEGF的表達降低，裸鼠的瘤體增殖也受到明顯抑制。

而整合素αvβ3作為腫瘤細胞上的一類受體，在正常骨組織中不表達或表達程度很低，但在骨肉瘤中表達明顯，也隨骨肉瘤惡性程度增加而增高［12］?？膳cⅠ、Ⅳ型膠原、LM、FN、纖維蛋白原等結(jié)合，增加瘤細胞的異質(zhì)黏附力，參與細胞內(nèi)外信息的傳遞過程，并在腫瘤的新生血管生成和轉(zhuǎn)移中起了重要的作用［13］。Lakshmikanthan等［14］在研究整合素與腫瘤血管之間關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ3可以通過多條途徑最終激活VEGF信號通路來調(diào)控腫瘤血管的生成。Lorger等［15］也發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ3可以與VEGF受體（VEGFR）發(fā)生交聯(lián)，協(xié)同強化VEGF對其受體的激活作用，促進血管的生成，從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，整合素αvβ3被認為是在腫瘤中新生血管中一種重要而獨立的預(yù)后標志。

本實驗通過聯(lián)合采用免疫組化SABC法和測定蛋白ALD的方法，發(fā)現(xiàn)了骨肉瘤組織中ADM和整合素αvβ3的表達與患者的性別、年齡、原發(fā)部位、GTM分期、FNCLCC腫瘤分級及組織學分型之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與腫瘤的體積大小和腫瘤是否轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。還證明了ADM和整合素αvβ3的表達強弱隨著骨肉瘤分期的上升逐漸增加，在不同的分期之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且二者在不同分期骨肉瘤組織中的表達水平呈正相關(guān)。這可能是由于ADM和整合素αvβ3都在腫瘤新生血管的過程中發(fā)揮著作用。分析其機制可能是：腫瘤細胞旺盛的增殖能力導(dǎo)致了腫瘤體積地快速增大，而僅靠其滲透作用而來的營養(yǎng)無法滿足自身需要，故需要形成大量的新生血管對腫瘤進行營養(yǎng)支持，此外腫瘤細胞還不斷分泌各種促進血管生成的細胞因子，如ADM和整合素αvβ3來緩解這種相對缺氧的狀態(tài)。目前已證實，ADM可抑制細胞的凋亡及促進腫瘤新生血管的產(chǎn)生［10，16］；整合素 αvβ3可參與新生的腫瘤血管內(nèi)皮細胞的遷移、黏附并形成管形，同時也為腫瘤轉(zhuǎn)移的提供了新通道［17］。

綜上所述，ADM和整合素αvβ3在腫瘤的發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要作用，且二者在腫瘤新生血管功能上有著相似的表現(xiàn)，提示二者之間可能存在協(xié)同促進作用，共同影響著腫瘤發(fā)生和發(fā)展。這也為聯(lián)合檢測骨肉瘤中整合素αvβ3與ADM的表達以預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的研究提供了研究方向；對研究ADM和整合素在骨肉瘤中的作用機制及其相互關(guān)系，以及對進一步揭示骨肉瘤的轉(zhuǎn)移機理有著重要理論價值。

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