吳銘+郭立泉+陳光

摘要:以Ⅵ型人膠原蛋白A2鏈基因為模板,PCR擴(kuò)增得到目的基因CP6,構(gòu)建了重組膠原蛋白表達(dá)載體,然后篩選高效表達(dá)的宿主菌,檢測重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及對重組菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,重組膠原蛋白在Rosetta(DE3)中表達(dá)量相對最高,重組質(zhì)粒穩(wěn)定性也較高。較佳的表達(dá)條件為接種量4%或5%,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600 nm為0.7時,加入0.5 mol/L IPTG,培養(yǎng)5 h,并且純化的重組蛋白與小鼠抗人COL6A2的單克隆抗體有特異性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞:膠原蛋白多肽;大腸桿菌(Escherichia coli);表達(dá);優(yōu)化

中圖分類號:Q812文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2443-05

Optimizing Expression of Recombinant Collagen Peptide in Escherichia coli

WU Ming1,2,GUO Li-quan1,CHEN Guang3

(1.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province,Jilin Business and Technology College,Changchun 130062,China;2.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China;

3.School of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China)

Abstract:Designed primers to obtain the target gene(CP6) fragment through PCR,the template contained the protein polypeptide gene of Ⅵ type human collagen,and constructed the recombinant plasmid,and then screened the host bacteria of high efficient expression,detected the instability of recombinant plasmid,as well as optimized the culture conditions.The results showed that the best host bacterium was Rosetta(DE3) and the recombinant plasmid has higher stability. The optimal expression conditions were inoculum of 4% and 5%,37 ℃,200 r/min,cultured to OD600 nm 0.7 and added 0.5 mol/L IPTG to the culture medium,and then cultured 5 h. Western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2.

Key words:collagen peptide;Escherichia coli;expression; optimization

基金項目:2014年吉林省教育廳項目;吉林省科技廳青年基金項目(20140520145JH);吉林省2012年博士后科研項目啟動項目

膠原蛋白多肽是運用鏈酶法水解對膠原蛋白進(jìn)行提取,將其水解成可溶解性的水解膠原蛋白。膠原蛋白多肽的功能與膠原蛋白有很多不同,并涉及到生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的活性物質(zhì)[1]。目前,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多生物體的多肽,而且?guī)缀跛猩镞^程都受到多肽的調(diào)節(jié),如神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和生長等。因此,在膠原蛋白的研究中,膠原蛋白多肽的研究已經(jīng)成為一個重要領(lǐng)域。在膠原蛋白的眾多類型中,Ⅵ型膠原蛋白(CⅥ)幾乎分布在所有結(jié)締組織中,而且它還具有維持組織完整性,能促進(jìn)增殖和抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞遷移、刺激DNA合成,具有生長因子的特性[2,3]。

目前,研究證明Ⅵ型膠原蛋白亞單位的基因突變是導(dǎo)致Bethlem肌病的主要原因,而且Ⅵ型膠原蛋白大量沉積能導(dǎo)致肝纖維化,Ⅵ型膠原蛋白還在細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)化方面具有一定作用。本研究構(gòu)建了含有人的Ⅵ型人膠原蛋白多肽基因的原核表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行表達(dá)研究,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理實驗室保存。大腸桿菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)均購自寶泰克生物有限公司。

1.2試劑與質(zhì)粒

ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Axygen凝膠回收試劑盒均購自上海捷瑞生物工程有限公司;小鼠抗人COL6A2蛋白抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。pCMV-SPORT6-CoL6A2由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理實驗室自行構(gòu)建;質(zhì)粒pET32a購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3方法

1.3.1引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中已報道的Col6A2序列中的開放閱讀框,利用Primer5.0軟件設(shè)計引物,P1為5′-ATCGAATTCGGCAACAAAGGAGC

CAAG-3′,P2為5′-ATCGTCGACGTTCTTGACAGCC

TCCTT-3′,分別含有EcoR I和Sal I酶切位點,由深圳華大基因科技有限公司合成引物。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以pCMV-SPORT6-Col6A2質(zhì)粒為模板,利用合成的引物,通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因CP6,PCR擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用Axygen凝膠回收試劑盒對目的基因片段進(jìn)行回收純化。將回收的目的基因CP6與pET32a載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶切處理鑒定陽性克隆,并送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3高效表達(dá)宿主菌的篩選以及重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性的檢測將重組質(zhì)粒pET32a-CP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3) 4種宿主菌中,以pET32a空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌作為空白對照。將陽性菌種作為出發(fā)菌,并用20%甘油保存該菌種作為第1代;7 d后,取200 μL第1代菌種接種到5 mL添加LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中培養(yǎng),并用甘油保存菌種,記為第2代,依此類推,共計15代,通過不同傳代次數(shù)對目的蛋白表達(dá)的影響來驗證pET32a-CP6質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。

1.3.4重組蛋白高效表達(dá)的培養(yǎng)條件從鑒定后的轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含 100 μg/mL Amp),37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm為0.7,然后根據(jù)不同的IPTG濃度、培養(yǎng)條件以及誘導(dǎo)時間等參數(shù),篩選最佳的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件,以空白載體的菌株作為空白對照。

1.3.5重組蛋白的Western blotting鑒定將純化的重組蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上,再將膜在5%的PBS緩沖液中室溫封閉2 h,洗膜后加入一抗在4 ℃放置2 h,洗膜后再加入二抗在4 ℃放置2 h,充分漂洗后加入化學(xué)發(fā)光底物Super Signal檢測試劑,暗室X光片暗匣曝光、顯影。一抗用的是Santa Cruz Biotechnology公司的COL6A2(1-YD19),該抗體是小鼠抗人COL6A2蛋白抗體,用于人類起源的COL6A2免疫印跡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因的PCR擴(kuò)增

以pCMV-SPORT6-CoL6A2質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增獲得目的基因CP6,以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可以看出,目的條帶大小為750 bp,與預(yù)期大小相符,并將PCR產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果驗證正確。

2.2重組質(zhì)粒pET32a-CP6的構(gòu)建

將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET32a連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過菌落PCR初步篩選,獲得的含有外源片段的重組質(zhì)粒pET32a-CP6,用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶切處理后可得到兩段片段(圖2),與預(yù)期大小一致,成功獲得含有目的基因片段的重組質(zhì)粒。

2.3高效表達(dá)宿主菌的篩選

取測序正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21、BL21(DE3)、 BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)4種宿菌,涂布于LB(含100 μg/mL Amp)固體培養(yǎng)基,隨機(jī)挑取單菌落過夜培養(yǎng),然后進(jìn)行菌落PCR驗證,篩選陽性重組菌,對陽性重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并收集表達(dá)的蛋白后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,從中篩選蛋白表達(dá)量高的重組菌株。從圖3可知,4號菌株Rosetta(DE3)的重組蛋白表達(dá)量相對最高,取其作為后期研究的重組菌,進(jìn)行大量培養(yǎng)。

2.4重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性檢測

大腸桿菌基因工程菌中質(zhì)粒穩(wěn)定性問題是基因工程菌實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的一個重要影響因素,主要原因是含有外源基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞后,會產(chǎn)生很多生理效應(yīng),從而影響到質(zhì)粒自身的穩(wěn)定性。因此,外源基因的表達(dá),不僅會導(dǎo)致宿主細(xì)胞自身生長速率的下降,而且會導(dǎo)致菌體形態(tài)的改變。這些影響主要表現(xiàn)為重組DNA質(zhì)粒的丟失和質(zhì)粒中的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生突變,能使細(xì)胞失去表達(dá)能力[5]。本試驗對重組質(zhì)粒pET32a-CP6的質(zhì)粒不穩(wěn)定性研究主要是通過不同傳代次數(shù)對目的蛋白表達(dá)的影響來驗證。將不同傳代次數(shù)的菌種涂布于100 μg/mL Amp的LB平板,37 ℃培養(yǎng)1~2 h,分別挑出單菌落接種到5 mL 含100 μg/mL Amp的 LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600 nm為0.7時,加入1 mol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h,取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測,主要檢測重組蛋白的表達(dá)量。

由圖4可以看出,重組菌株表達(dá)重組蛋白的效率在不同的傳代次數(shù)上幾乎沒有差異性。隨著傳代次數(shù)增加,沒有出現(xiàn)質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性現(xiàn)象,表明成功構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)蛋白的重組表達(dá)菌株。

2.5重組蛋白表達(dá)培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.5.1 接種量對重組蛋白表達(dá)量的影響在相同的搖瓶和相同裝液量的情況下,不同的接種量會對目的蛋白的表達(dá)造成影響。接種量依次按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和10%接入含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基。37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600 nm為0.7時,加入1 mol/L的IPTG,然后培養(yǎng)6 h,取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)量。從圖5中可以看出,在相同培養(yǎng)條件下,當(dāng)接種量為4%和5%時,重組蛋白的表達(dá)量較高。隨著接種量的增加,重組蛋白的表達(dá)量呈明顯的下降趨勢,當(dāng)接種量達(dá)為10%時,重組蛋白表達(dá)甚微。

2.5.2IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)量的影響4%接種后,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600 nm為0.7時,向培養(yǎng)基中加入終濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的IPTG,然后培養(yǎng)6 h,取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)量。由圖6可以看出,IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)量的影響不大,考慮到IPTG的毒性和成本,最終確定IPTG濃度為0.5 mol/L時效果最佳。

2.5.3IPTG添加時間對重組蛋白表達(dá)量的影響在50 mL LB液體培養(yǎng)基,4%接種后37 ℃、200 r/min培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600 nm分別為0.3、0.5、0.6、0.7、0.8時,添加0.5 mol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),然后培養(yǎng)6 h,取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)量。從圖7分析可知,OD600 nm為0.3時重組蛋白的表達(dá)量很低,而OD600 nm為0.5、0.6、0.7、0.8時添加IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)量差異不大,最后綜合考慮選擇在OD600 nm為0.7時添加IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。

2.5.4IPTG誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)量的影響在LB液體培養(yǎng)基中,4%接種后,37 ℃、200 r/min培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600 nm為0.7時,向培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L IPTG,然后分別培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9、10 h,取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)量。從圖8可以看出,在加入IPTG誘導(dǎo)5 h時,重組蛋白的表達(dá)量最高,綜合考慮,誘導(dǎo)5 h為最佳誘導(dǎo)時間。

3小結(jié)與討論

目前,膠原蛋白的提取主要采取傳統(tǒng)的提取方法,利用酸、堿水解法從動物的結(jié)締組織(如豬皮、魚皮、驢皮、牛皮等)中提取膠原蛋白,但是提取過程中會使其喪失部分的生物活性,并且提取得到的產(chǎn)品成分也非常復(fù)雜[5-8];其次就是利用酶解法提取膠原蛋白,這種方法具有較高的回收率,反應(yīng)速度快,反應(yīng)時間短,但是從動物組織提取的膠原蛋白多數(shù)不溶于水,并且也不可能在不改變分子質(zhì)量的前提下重新溶解。因此,從動物組織提取的膠原蛋白可加工性弱,這就直接限制了膠原蛋白在許多方面的應(yīng)用[2-6]?；蚬こ谭ㄉa(chǎn)的膠原蛋白具有安全性好、重現(xiàn)性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點,同時也能改善膠原蛋白的免疫排異性、親水性等性能,從而解決了傳統(tǒng)提取方法存在的很多缺點。

目前有關(guān)在原核細(xì)胞中表達(dá)膠原蛋白的相關(guān)研究不多,有許多問題尚待解決。首先,重組質(zhì)粒上的膠原蛋白目的基因在宿主菌中是否穩(wěn)定;其次,重組膠原蛋白在宿主菌中是否穩(wěn)定,對宿主菌有多大的毒害作用。由于人工重組質(zhì)粒往往表現(xiàn)出不穩(wěn)定性[5],因此對重組菌,特別是用于生產(chǎn)的重組工程菌進(jìn)行重組質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性的研究是十分必要的。所謂質(zhì)粒不穩(wěn)定性是指工程菌在生長過程中質(zhì)粒發(fā)生變化,結(jié)果不呈現(xiàn)原有的表型特征[5]。因為外源基因的插入勢必會影響到質(zhì)粒原有的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制,一是插入的位點與質(zhì)粒的穩(wěn)定性有關(guān);二是插入的外源基因一般表達(dá)真核細(xì)胞的蛋白。這樣必然影響到宿主細(xì)胞本身基因的表達(dá),改變宿主菌正常的生理狀況,從而影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性[5]。通過鑒定連續(xù)傳代中不同代次重組菌菌落的氨芐青霉素抗性,可以獲得質(zhì)粒丟失菌的比例。結(jié)果表明,該重組菌在連續(xù)培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失菌,工程菌株表達(dá)重組蛋白的效率在不同的傳代次數(shù)上幾乎沒有差異性,而且隨著傳代次數(shù)的增加,并沒有出現(xiàn)質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性現(xiàn)象。同時需要注意的是該重組菌在高密度發(fā)酵條件下的遺傳穩(wěn)定性需要進(jìn)一步驗證。

本研究利用基因工程的方法對人的Ⅵ型膠原蛋白多肽進(jìn)行重組表達(dá)和純化,并對膠原性多肽在原核細(xì)胞中的表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明,接種量對重組蛋白的影響明顯,當(dāng)接種量過大時,就會直接影響菌體生長狀態(tài),影響重組蛋白的表達(dá);溶氧量過小會導(dǎo)致菌體生長不足,從而影響重組蛋白的表達(dá);IPTG的濃度對重組蛋白表達(dá)率的影響不大,綜合考慮,選擇接種量4%或5%,IPTG濃度為0.5 mol/L,IPTG添加時間為OD600 nm為0.7,IPTG誘導(dǎo)時間為5 h作為蛋白表達(dá)的較佳條件。原核表達(dá)體系與其他表達(dá)體系相比,大腸桿菌作為真核基因的表達(dá)宿主具有很多優(yōu)點,如遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡便、培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模發(fā)酵成本低、繁殖快及生長周期短等[9-13],因此本研究選用大腸桿菌表達(dá)體系,利用基因工程法生產(chǎn)膠原蛋白多肽,但是目前僅是對工程菌的構(gòu)建和表達(dá)做了初步的研究,后續(xù)重組蛋白的純化和活性驗證還有待深入的研究。

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本研究利用基因工程的方法對人的Ⅵ型膠原蛋白多肽進(jìn)行重組表達(dá)和純化,并對膠原性多肽在原核細(xì)胞中的表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明,接種量對重組蛋白的影響明顯,當(dāng)接種量過大時,就會直接影響菌體生長狀態(tài),影響重組蛋白的表達(dá);溶氧量過小會導(dǎo)致菌體生長不足,從而影響重組蛋白的表達(dá);IPTG的濃度對重組蛋白表達(dá)率的影響不大,綜合考慮,選擇接種量4%或5%,IPTG濃度為0.5 mol/L,IPTG添加時間為OD600 nm為0.7,IPTG誘導(dǎo)時間為5 h作為蛋白表達(dá)的較佳條件。原核表達(dá)體系與其他表達(dá)體系相比,大腸桿菌作為真核基因的表達(dá)宿主具有很多優(yōu)點,如遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡便、培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模發(fā)酵成本低、繁殖快及生長周期短等[9-13],因此本研究選用大腸桿菌表達(dá)體系,利用基因工程法生產(chǎn)膠原蛋白多肽,但是目前僅是對工程菌的構(gòu)建和表達(dá)做了初步的研究,后續(xù)重組蛋白的純化和活性驗證還有待深入的研究。

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本研究利用基因工程的方法對人的Ⅵ型膠原蛋白多肽進(jìn)行重組表達(dá)和純化,并對膠原性多肽在原核細(xì)胞中的表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明,接種量對重組蛋白的影響明顯,當(dāng)接種量過大時,就會直接影響菌體生長狀態(tài),影響重組蛋白的表達(dá);溶氧量過小會導(dǎo)致菌體生長不足,從而影響重組蛋白的表達(dá);IPTG的濃度對重組蛋白表達(dá)率的影響不大,綜合考慮,選擇接種量4%或5%,IPTG濃度為0.5 mol/L,IPTG添加時間為OD600 nm為0.7,IPTG誘導(dǎo)時間為5 h作為蛋白表達(dá)的較佳條件。原核表達(dá)體系與其他表達(dá)體系相比,大腸桿菌作為真核基因的表達(dá)宿主具有很多優(yōu)點,如遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡便、培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模發(fā)酵成本低、繁殖快及生長周期短等[9-13],因此本研究選用大腸桿菌表達(dá)體系,利用基因工程法生產(chǎn)膠原蛋白多肽,但是目前僅是對工程菌的構(gòu)建和表達(dá)做了初步的研究,后續(xù)重組蛋白的純化和活性驗證還有待深入的研究。

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