賴樹錦+郭佳+陶新園+李陽+楊振飛+陳鑫+李曉華

摘要:用Roling法、SDS法、CTAB改進法和Crump改進法提取水體微生物總DNA,并以細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增。研究結果表明,四種提取方法提取的水體微生物總DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的水體微生物總DNA的濃度明顯小于其他3種方法,Crump改進法提取的水體微生物總DNA的A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值高于其他3種方法,Crump改進法所提取的微生物總DNA可以直接用于后續(xù)的PCR擴增試驗。

關鍵詞:水體微生物;總DNA提取;DNA質(zhì)量;PCR擴增

中圖分類號:Q939文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2440-03

Comparison of Several Methods for Extraction of Total Community for Water

LAI Shu-jin,GUO Jia,TAO Xin-yuan,LI Yang,YANG Zhen-fei,CHEN Xin,LI Xiao-hua

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission/College of Life Science, South -Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

Abstract: The total community DNA from water was extracted by the Roling method, SDS method, CTAB method and Crump method respectively, then the universal primers for 16S rDNA was used for PCR amplification.The results showed that the DNA extractions were above 23.1 kb. The lesser amount of DNA and little impurities were extracted by Roling method , Highest amount of DNA was extracted by Crump method . Which A260/A280 andA260/A230ratio is higher than other three methods.

Key words: water; DNA extraction; DNA qulity; PCR amplification

基金項目:國家自然科學基金項目(31070087,30570046);湖北省自然科學基金重點項目(2011CDA079);國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(GCX13104);湖北省煙草公司面上資助項目(0710XYYC2012-01)

水體中微生物種類繁多、數(shù)量巨大。污染的水體中微生物尤其多,種類僅次于土壤[1]。微生物具有很強的降解和轉化污染物的能力,因此在被污染的水體中起著重要的作用[2-3]。微生物的多樣性和群落結構的研究一直沿用分離、培養(yǎng)、鑒定并描述特征的傳統(tǒng)方法,然而研究證明至今自然界中85%~99.9%的微生物不可培養(yǎng),依賴傳統(tǒng)的方法將損失大部分微生物資源。因此,很多研究者更傾向于從環(huán)境中直接提取微生物的總DNA,利用16S rDNA基因序列分析來研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物的種群結構[4]。

由于水體環(huán)境復雜,從水體中抽提的微生物總DNA存在很多抑制因子,如腐蝕酸、腐殖酸樣物、酚類化合物等[5]。這些抑制因子會嚴重抑制PCR反應和酶切分析的進行[6]。因此從水體中提取高質(zhì)量的微生物總DNA是分子水平研究水體微生物多樣性的重要步驟。

本研究通過對四種水體微生物總DNA提取方法進行比較分析,確定了一種較理想的水體微生物總DNA提取方法,為更好地開發(fā)利用水體未培養(yǎng)微生物資源提供了有力工具。

1材料與方法

1.1材料

水樣取自武漢市南湖。

1.2水樣預處理

取試驗所用的新鮮南湖水樣,用真空泵對其進行過濾,壓力為0.3 MPA,濾膜孔徑為0.22 μm,直徑為10 cm,壓濾后將濾膜放置于-20 ℃保存,用于后續(xù)試驗。

1.3水體微生物總DNA的提取

1.3.1Roling法[7]用0.8 mL緩沖液(1% SDS、120 mmol/L K2HPO4)重懸沉淀,轉移至2 mL專用離心管內(nèi),加入0.6 g直徑為0.1 mm的玻璃球和0.7 mL飽和酚,用Bead beater以4 200 r/min振蕩3次,每次30 s,取上清。

1.3.2SDS法[8]用700μL SDS裂解液重懸沉淀,加300 μL60 mg/mL溶菌酶,37℃溫育1h,加4 μL200mg/mL蛋白酶K和240μL 10% SDS,55 ℃溫育30min。13 000r/min離心5min,取上清。

1.3.3CTAB改進法[9]沉淀重懸于400μL pH 8.0的STET緩沖液(8%蔗糖、0.5% Tween-20、50 mmol/L EDTA、50mmol/L Tris)中,加入80μL 50 mg/mL溶菌酶,加入20% SDS至終濃度為0.5%,加入200mg/mL蛋白酶K至終濃度為100μL/mL,混均后37 ℃溫育1h。加入5mol/L NaCl至終濃度為0.5 mol/L,加80 μL pH 8.0CTAB溶液(5% CTAB、120 mol/L K2HPO4)混勻,65 ℃溫育10 min。13 000 r/min離心5 min,取上清。

1.3.4Crump 改進法[10]加入3 mL pH 8.0 DNA提取液(100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、1.5 mol/L NaCl、0.01 g/mL PVPP、2% CTAB、100 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液)充分漩渦震蕩,加入0.1 mL 50 mg/mL溶菌酶,37 ℃水浴1 h,每隔15 min輕輕震蕩混勻,加入10% SDS至終濃度為0.5%,65 ℃水浴1 h,每隔15 min輕輕震蕩混勻,13 000 r/min離心5 min,取上清。

1.4DNA抽提和沉淀

分別用等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1體積比)、氯仿/異戊醇(24∶1體積比)、氯仿各抽提一次,每次抽提用13 000 r/min離心10 min后取水相。加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉、0.6倍體積的異丙醇,常溫下放置2 h,13 000 r/min離心20 min,取沉淀。加入0.5 mL 70%(體積分數(shù))乙醇洗滌,重復3次,每次輕輕混勻洗滌、離心、棄乙醇。37 ℃放置,晾干后溶于20 μL TE,-20 ℃保存。

1.5DNA純度的測定

用紫外線分光光度法分別測定DNA溶液的A260 nm、A280 nm和A230 nm,用A260 nm /A230 nm、A260 nm /A280 nm、蛋白質(zhì)的濃度(μg/mL)和核酸的濃度(ng/μL)作為評價指標。

1.6PCR擴增反應

用細菌的16S rDNA通用引物進行擴增,P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,P2:5-TACCTT GTTACGACTT-3。PCR反應體系為20 μL,包括模板DNA1 μL、Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、20 pmol/μL 引物1(P1)1 μL、20 pmol/μL引物2(P2)1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL,去離子水13.5 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸30 min,4 ℃保溫1 h。

2結果與分析

2.14種水體微生物總DNA提取方法的DNA提取量和分子量大小

用4種水體微生物總DNA提取方法提取南湖水體中微生物總DNA,并進行瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1所示,4種方法均可以提取出南湖水體中微生物總DNA,4種提取方法提取的總DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的南湖水體中微生物總DNA的濃度明顯小于其他3種方法。

2.24種水體微生物總DNA提取方法的DNA純度

從水體中提取的微生物總DNA容易受到蛋白質(zhì)、腐殖酸、酚類化合物等物質(zhì)的污染[11],進而影響后續(xù)的實驗操作。通常用A260 nm/A280 nm比值表征DNA受到蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染狀況,用A260 nm/A230 nm比值表征DNA受到糖類、鹽類等雜質(zhì)的污染狀況。由圖2可知,Roling法提取的水體微生物總DNA A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值均小于1.5,表明蛋白質(zhì)、腐殖酸等雜質(zhì)成分較多,SDS法和CATB改進法所提取的水體微生物總DNA的純度有所提高,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高。

2.3PCR擴增結果

為檢驗從水體中提取的微生物總DNA能否用于后續(xù)的PCR擴增等試驗,以所提取的微生物總DNA為模板,用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增,凝脈電泳檢測結果如圖3所示。Roling法、SDS法和CTAB改進法所提取的微生物總DNA擴增不出條帶,表明這3種方法提取出的DNA受污染情況嚴重,與2.2中DNA純度分析的結果一致;只有Crump改進法所提取的微生物總DNA能擴增出目標條帶,表明Crump改進法所提取的微生物總DNA純度高于其他3種方法,可以直接用于后續(xù)的PCR擴增等試驗。

3討論

由于水體中微生物種類繁多、數(shù)量巨大,常規(guī)培養(yǎng)法無法體現(xiàn)水體微生物的多樣性和種群情況。鑒于以上研究現(xiàn)狀,基于群體基因組的方法研究水體微生物多樣性的策略得到了廣泛應用,其中最關鍵的是高質(zhì)量水體微生物總DNA的提取。

本研究用Roling法、SDS法、CTAB改進法和Crump改進法提取水體微生物總DNA,四種方法都可以提取出南湖水體中微生物總DNA,但在DNA純度上存在差異,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高,可以用于后續(xù)的PCR擴增試驗。

參考文獻

[1] 王曉丹,李艷紅.分子生物學方法在水體微生物生態(tài)研究中的應用[J].微生物學通報,2007,34(4):777.

[2] KISAND V,WIKNER J.Limited resolution of 16S rDNA DGGE caused by melting properties and closely related DNA sequences[J].Journal of Microbiological Method,2003,54(2):183-191.

[3] YUAN S Y,YU C H,CHANG B V,et al.Biodegradation of nonylphenol in river sediment[J]. Environmental Pollution,2004,127(3):425-430.

[4] 邵繼海,何紹江,馮新梅.四種土壤微生物總DNA純化方法的比較[J].微生物學雜志,2005,25(3):1-4.

[5] PORTEOUS L A,AMSTRONG J L.A simple mini-method to extract DNA directly from soil for use with polymerase chain reaction amplification[J].Curr Microbial,1993,27(2):115-118.

[6] 張瑞福,曹慧,崔中利,等.土壤微生物總DNA的提取和純化[J].微生物學報,2003,43(2)276-282.

[7] ROLING W F,BREUKELEN B M,BRASTER M,et al.Relationships between microbial community structure and hydrochemistry in a Landfill Leachate-Polluted Aquifer[J].Appl Environ Microbiol,2001,67:4629-4919.

[8] 趙裕棟,周俊,何璟.土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化[J].微生物學報,2012,52(9):1143-1150.

[9] 張穎慧,魏東盛,邢來君,等.一種改進的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學通報,2008,35(3):466-469.

[10] CRUMP B C,ARMBRUST E V,BAROSS J A.Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia river,its estuary,and the adjacent coastal ocean[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(7):3192-3204.

[11] 王家昕,譚暉,李曉華,等.幾種土壤微生物總DNA提取方法的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2010,49(11):2651-2653.

1.6PCR擴增反應

用細菌的16S rDNA通用引物進行擴增,P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,P2:5-TACCTT GTTACGACTT-3。PCR反應體系為20 μL,包括模板DNA1 μL、Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、20 pmol/μL 引物1(P1)1 μL、20 pmol/μL引物2(P2)1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL,去離子水13.5 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸30 min,4 ℃保溫1 h。

2結果與分析

2.14種水體微生物總DNA提取方法的DNA提取量和分子量大小

用4種水體微生物總DNA提取方法提取南湖水體中微生物總DNA,并進行瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1所示,4種方法均可以提取出南湖水體中微生物總DNA,4種提取方法提取的總DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的南湖水體中微生物總DNA的濃度明顯小于其他3種方法。

2.24種水體微生物總DNA提取方法的DNA純度

從水體中提取的微生物總DNA容易受到蛋白質(zhì)、腐殖酸、酚類化合物等物質(zhì)的污染[11],進而影響后續(xù)的實驗操作。通常用A260 nm/A280 nm比值表征DNA受到蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染狀況,用A260 nm/A230 nm比值表征DNA受到糖類、鹽類等雜質(zhì)的污染狀況。由圖2可知,Roling法提取的水體微生物總DNA A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值均小于1.5,表明蛋白質(zhì)、腐殖酸等雜質(zhì)成分較多,SDS法和CATB改進法所提取的水體微生物總DNA的純度有所提高,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高。

2.3PCR擴增結果

為檢驗從水體中提取的微生物總DNA能否用于后續(xù)的PCR擴增等試驗,以所提取的微生物總DNA為模板,用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增,凝脈電泳檢測結果如圖3所示。Roling法、SDS法和CTAB改進法所提取的微生物總DNA擴增不出條帶,表明這3種方法提取出的DNA受污染情況嚴重,與2.2中DNA純度分析的結果一致;只有Crump改進法所提取的微生物總DNA能擴增出目標條帶,表明Crump改進法所提取的微生物總DNA純度高于其他3種方法,可以直接用于后續(xù)的PCR擴增等試驗。

3討論

由于水體中微生物種類繁多、數(shù)量巨大,常規(guī)培養(yǎng)法無法體現(xiàn)水體微生物的多樣性和種群情況。鑒于以上研究現(xiàn)狀,基于群體基因組的方法研究水體微生物多樣性的策略得到了廣泛應用,其中最關鍵的是高質(zhì)量水體微生物總DNA的提取。

本研究用Roling法、SDS法、CTAB改進法和Crump改進法提取水體微生物總DNA,四種方法都可以提取出南湖水體中微生物總DNA,但在DNA純度上存在差異,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高,可以用于后續(xù)的PCR擴增試驗。

參考文獻

[1] 王曉丹,李艷紅.分子生物學方法在水體微生物生態(tài)研究中的應用[J].微生物學通報,2007,34(4):777.

[2] KISAND V,WIKNER J.Limited resolution of 16S rDNA DGGE caused by melting properties and closely related DNA sequences[J].Journal of Microbiological Method,2003,54(2):183-191.

[3] YUAN S Y,YU C H,CHANG B V,et al.Biodegradation of nonylphenol in river sediment[J]. Environmental Pollution,2004,127(3):425-430.

[4] 邵繼海,何紹江,馮新梅.四種土壤微生物總DNA純化方法的比較[J].微生物學雜志,2005,25(3):1-4.

[5] PORTEOUS L A,AMSTRONG J L.A simple mini-method to extract DNA directly from soil for use with polymerase chain reaction amplification[J].Curr Microbial,1993,27(2):115-118.

[6] 張瑞福,曹慧,崔中利,等.土壤微生物總DNA的提取和純化[J].微生物學報,2003,43(2)276-282.

[7] ROLING W F,BREUKELEN B M,BRASTER M,et al.Relationships between microbial community structure and hydrochemistry in a Landfill Leachate-Polluted Aquifer[J].Appl Environ Microbiol,2001,67:4629-4919.

[8] 趙裕棟,周俊,何璟.土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化[J].微生物學報,2012,52(9):1143-1150.

[9] 張穎慧,魏東盛,邢來君,等.一種改進的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學通報,2008,35(3):466-469.

[10] CRUMP B C,ARMBRUST E V,BAROSS J A.Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia river,its estuary,and the adjacent coastal ocean[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(7):3192-3204.

[11] 王家昕,譚暉,李曉華,等.幾種土壤微生物總DNA提取方法的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2010,49(11):2651-2653.

1.6PCR擴增反應

用細菌的16S rDNA通用引物進行擴增,P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,P2:5-TACCTT GTTACGACTT-3。PCR反應體系為20 μL,包括模板DNA1 μL、Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、20 pmol/μL 引物1(P1)1 μL、20 pmol/μL引物2(P2)1 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL,去離子水13.5 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃延伸30 min,4 ℃保溫1 h。

2結果與分析

2.14種水體微生物總DNA提取方法的DNA提取量和分子量大小

用4種水體微生物總DNA提取方法提取南湖水體中微生物總DNA,并進行瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1所示,4種方法均可以提取出南湖水體中微生物總DNA,4種提取方法提取的總DNA大小都在23 kb以上,Roling法提取的南湖水體中微生物總DNA的濃度明顯小于其他3種方法。

2.24種水體微生物總DNA提取方法的DNA純度

從水體中提取的微生物總DNA容易受到蛋白質(zhì)、腐殖酸、酚類化合物等物質(zhì)的污染[11],進而影響后續(xù)的實驗操作。通常用A260 nm/A280 nm比值表征DNA受到蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染狀況,用A260 nm/A230 nm比值表征DNA受到糖類、鹽類等雜質(zhì)的污染狀況。由圖2可知,Roling法提取的水體微生物總DNA A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值均小于1.5,表明蛋白質(zhì)、腐殖酸等雜質(zhì)成分較多,SDS法和CATB改進法所提取的水體微生物總DNA的純度有所提高,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高。

2.3PCR擴增結果

為檢驗從水體中提取的微生物總DNA能否用于后續(xù)的PCR擴增等試驗,以所提取的微生物總DNA為模板,用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增,凝脈電泳檢測結果如圖3所示。Roling法、SDS法和CTAB改進法所提取的微生物總DNA擴增不出條帶,表明這3種方法提取出的DNA受污染情況嚴重,與2.2中DNA純度分析的結果一致;只有Crump改進法所提取的微生物總DNA能擴增出目標條帶,表明Crump改進法所提取的微生物總DNA純度高于其他3種方法,可以直接用于后續(xù)的PCR擴增等試驗。

3討論

由于水體中微生物種類繁多、數(shù)量巨大,常規(guī)培養(yǎng)法無法體現(xiàn)水體微生物的多樣性和種群情況。鑒于以上研究現(xiàn)狀,基于群體基因組的方法研究水體微生物多樣性的策略得到了廣泛應用,其中最關鍵的是高質(zhì)量水體微生物總DNA的提取。

本研究用Roling法、SDS法、CTAB改進法和Crump改進法提取水體微生物總DNA,四種方法都可以提取出南湖水體中微生物總DNA,但在DNA純度上存在差異,Crump改進法提取的水體微生物總DNA純度最高,可以用于后續(xù)的PCR擴增試驗。

參考文獻

[1] 王曉丹,李艷紅.分子生物學方法在水體微生物生態(tài)研究中的應用[J].微生物學通報,2007,34(4):777.

[2] KISAND V,WIKNER J.Limited resolution of 16S rDNA DGGE caused by melting properties and closely related DNA sequences[J].Journal of Microbiological Method,2003,54(2):183-191.

[3] YUAN S Y,YU C H,CHANG B V,et al.Biodegradation of nonylphenol in river sediment[J]. Environmental Pollution,2004,127(3):425-430.

[4] 邵繼海,何紹江,馮新梅.四種土壤微生物總DNA純化方法的比較[J].微生物學雜志,2005,25(3):1-4.

[5] PORTEOUS L A,AMSTRONG J L.A simple mini-method to extract DNA directly from soil for use with polymerase chain reaction amplification[J].Curr Microbial,1993,27(2):115-118.

[6] 張瑞福,曹慧,崔中利,等.土壤微生物總DNA的提取和純化[J].微生物學報,2003,43(2)276-282.

[7] ROLING W F,BREUKELEN B M,BRASTER M,et al.Relationships between microbial community structure and hydrochemistry in a Landfill Leachate-Polluted Aquifer[J].Appl Environ Microbiol,2001,67:4629-4919.

[8] 趙裕棟,周俊,何璟.土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化[J].微生物學報,2012,52(9):1143-1150.

[9] 張穎慧,魏東盛,邢來君,等.一種改進的絲狀真菌DNA提取方法[J].微生物學通報,2008,35(3):466-469.

[10] CRUMP B C,ARMBRUST E V,BAROSS J A.Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia river,its estuary,and the adjacent coastal ocean[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(7):3192-3204.

[11] 王家昕,譚暉,李曉華,等.幾種土壤微生物總DNA提取方法的比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2010,49(11):2651-2653.