楚紅英+陳志冉+李瑜

摘要:采用超聲波輔助提取技術,通過單因素試驗和L9(34)正交試驗,探討了提取條件對火棘(Pyracantha fortuneana)中多糖類物質提取率的影響,采用苯酚-硫酸法測定火棘中多糖含量,以葡萄糖作為標準對照物,在482 nm處測定吸光度,并計算其含量。結果表明,在火棘多糖超聲波最佳提取工藝條件下(提取劑pH為7,30 ℃下按液料比30∶1提取40 min),火棘果中多糖提取率達2.148%。

關鍵詞:火棘(Pyracantha fortuneana);多糖;提取;苯酚-硫酸法

中圖分類號:TQ351;TQ91文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2408-04

Extraction and Determination of Polysaccharides in Pyracantha fortuneana

CHU Hong-ying1,CHEN Zhi-ran1,LI Yu2

(1.Department of Environment and Chemical Engineering,Yellow River Conservancy Technical Institute,Kaifeng 475004,Henan,China;2.Department of Urology,Zhengzhou Peoples Hospital Yi He Hospital,Zhengzhou 450047,Henan,China)

Abstract:The conditions of ultrasound-assisted extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were studied with single factor analysis and L9(34) orthogonal experiment. The content of polysaccharides in Pyracantha fortuneana was determined by phenol-H2SO4 colorimetry at 482 nm with glucose as the standard. The results showed that the optimal conditions of ultrasonic extracting polysaccharides from Pyracantha fortuneana were 30 ℃ for 40 min with pH 7 and the best ratio of liquid (mL) to solid(g) was 30∶1.Under the optimal conditions,the yield of polysaccharides from Pyracantha fortuneana was 2.148%.

Key words: Pyracantha fortuneana;polysaccharides;extraction;phenol-H2SO4 colorimetry

基金項目:黃河水利職業(yè)技術學院科研基金項目(2013KYJS012)

火棘(Pyracantha fortuneana)又名救兵糧、救命糧、火把果、赤陽子等,為薔薇科火棘屬常綠灌木或小喬木[1]?；鸺粌H具有觀賞價值,而且還具有食用和藥用價值,火棘中含有β-谷甾醇、北美圣草素、蘆丁、芒苷、異槲皮苷、槲皮素和超氧化物歧化酶等活性成分[2,3]。研究表明,火棘具有抗氧化、增強免疫力、利膽、助消化、降血脂和抗疲勞等作用,根、皮、葉均具有生津止渴、清熱解毒、收斂止瀉之功效,其果可用于療瘡毒、治陰虛、止瀉痢等[4],火棘還具有美白作用[5]。作為植物光合作用的初生產物,多糖不僅是多數天然產物合成的初始原料,也是動植物維持生命不可缺少的一類化合物[6]。目前,多糖提取主要包括:熱水浸提、熱熔、超聲、微波、酶解等方法[7-10],測定方法主要包括3,5-二硝基水楊酸鹽比色法、Somogyi-Nelson法、地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法等方法[11]。本試驗采用超聲法提取,苯酚-硫酸法測定火棘中的水溶性多糖,旨在為開發(fā)利用火棘資源提供參考。

1材料與方法

1.1材料

火棘樣品采自黃河水利職業(yè)技術學院;所用試劑均為分析純試劑,去離子水。

1.2儀器

PB1502-L型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);ZRD-8210型電熱風干燥箱(上海智誠分析儀器制造有限公司);TU-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);HC-3018R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);DJZ型粉碎機(常州市日宏佳爾特粉體設備有限公司)。

1.3方法

1.3.1樣品預處理取新鮮火棘,去除雜物,洗凈,自然風干,50 ℃烘干至恒重,粉碎,密封保存于棕色瓶中備用。

1.3.2樣品提取稱取1.000 0 g火棘粉,按一定比例加入去離子水,在超聲條件下提取:超聲功率為500 W,趁熱抽濾,定容至50 mL,取出5 mL,用無水乙醇定容至25 mL,混勻,靜置過夜后,以10 000 r/min離心5 min,棄上清液,沉淀用80%(V/V)乙醇洗滌2次,加入去離子水,加熱溶解,定容至25 mL,即為待測樣品溶液。

1.3.3標準樣品溶液的配制稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品0.050 0 g于100 mL容量瓶中,去離子水定容,搖勻,得0.500 g/L的標準溶液。

1.3.4最大吸收波長的選擇用移液管準確吸取一定量的標準溶液于10 mL具塞比色管中,用去離子水定容至2 mL,加入0.6%(m/V,下同)苯酚0.5 mL,濃硫酸定容,將樣品于紫外-可見分光光度計上掃描。

1.3.5試樣中多糖含量的測定 吸取待測試樣1.00 mL于10 mL比色管中,按上述1.3.4步驟操作,測定其吸光度值,代入線性回歸方程算出對應試樣中多糖的含量。

2結果與討論

2.1檢測波長和標準曲線

樣品在450~550 nm的紫外-可見吸收圖譜見圖1,由圖1可知,樣品在482 nm處有最大吸收,故選擇482 nm為檢測波長。

分別移取0~1.00 mL系列體積的葡萄糖標準溶液于10 mL比色管中,去離子水定容至2 mL,加入0.6%苯酚0.5 mL,用濃硫酸定容至刻度,冷卻至室溫,以試劑空白溶液為參比,測定482 nm處吸光度,以葡萄糖質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,如圖2所示,得線性回歸方程:A=0.033 7 C+0.080 1,r=0.998 8,在0~50 mg/L之間呈良好線性關系。

2.2條件優(yōu)化

以11月火棘果為分析試樣,研究pH、液料比、提取時間和提取溫度對多糖提取率的影響。

2.2.1pH對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1(mL∶g,下同),60 ℃提取20 min,分析不同pH的提取劑提取效果,結果見圖3。由圖3可知,提取劑pH在5~7范圍,多糖提取率與pH呈負相關,pH大于7時,對多糖提取影響不大。故當提取劑pH為5時,多糖提取率較高。

2.2.2液料比對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對提取率的影響見圖4。由圖4可知,當液料比為30∶1時,多糖提取率最高。當液料比較小時,物料與提取液接觸不充分,導致提取率較低;而當液料比為30∶1至60∶1時,提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時間對多糖提取率的影響稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時間對多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知,隨著超聲時間的增加,多糖提取率升高。當提取溫度超過30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時間20 ℃,不同溫度對多糖提取率的影響見圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時,多糖提取率與溫度呈負相關,40~70 ℃時,多糖提取率與溫度呈正相關。

2.3正交試驗結果

為全面考察多糖提取的工藝參數,根據單因素試驗結果及相關文獻[7-10],以提取溫度、pH、提取時間及液料比4個因素進行正交試驗,采用L9(34)正交試驗方法以確定提取最佳條件,正交試驗設計及結果見表1。

由各因素極差分析可知,對多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗中并沒有出現,為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對火棘果樣品進行分析,結果見表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實際樣品分析結果

在上述A1B3C2D2條件下,對9~12月份火棘的葉和果進行了多糖的提取與測定,其對應含量如表3所示。

結果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢?？偟膩碚f,火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖?？梢钥闯龌鸺泻胸S富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗中的3號樣品平行測定5次,結果表明,測定結果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測定3號樣品,連續(xù)測定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內穩(wěn)定。

3結論

本試驗以火棘為研究對象,探討了火棘中多糖的提取及含量測定。試驗結果表明,各因素的主次關系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見分光光度計測定火棘中多糖的含量?；鸺~中的多糖含量高于果實,火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關結果將為火棘資源開發(fā)利用提供參考。

參考文獻:

[1] 曾令貴,鐘露苗.火棘的研究現狀與應用概況[J].中國藥事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蔣利華,熊遠福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究進展[J].中國野生植物資源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李維熙,李怡芳,等.火棘果實提取物的美白作用[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(2):184-188.

[6] 吳立軍.天然藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988.

[7] 黃妮,熊雙麗,盧飛.綿麥冬多糖的分離純化及自由基清除活性[J].林產化學與工業(yè),2011,31(1):68-72.

[8] 李潤豐,常學東,陳雪娜.板栗多糖提取工藝的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(2):96-100.

[9] 莊永亮,孫麗平,尚小麗.紅托竹蓀菌蓋多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(3):45-49.

[10] 楊勝利,劉敏,錢俊青.香菇多糖酶催化酯化技術及其抗病毒活性研究[J].生物質化學工程,2009,43(4):29-32.

[11] 劉丹.對多糖測定方法的探討[J].四川文理學院學報,2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對提取率的影響見圖4。由圖4可知,當液料比為30∶1時,多糖提取率最高。當液料比較小時,物料與提取液接觸不充分,導致提取率較低;而當液料比為30∶1至60∶1時,提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時間對多糖提取率的影響稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時間對多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知,隨著超聲時間的增加,多糖提取率升高。當提取溫度超過30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時間20 ℃,不同溫度對多糖提取率的影響見圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時,多糖提取率與溫度呈負相關,40~70 ℃時,多糖提取率與溫度呈正相關。

2.3正交試驗結果

為全面考察多糖提取的工藝參數,根據單因素試驗結果及相關文獻[7-10],以提取溫度、pH、提取時間及液料比4個因素進行正交試驗,采用L9(34)正交試驗方法以確定提取最佳條件,正交試驗設計及結果見表1。

由各因素極差分析可知,對多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗中并沒有出現,為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對火棘果樣品進行分析,結果見表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實際樣品分析結果

在上述A1B3C2D2條件下,對9~12月份火棘的葉和果進行了多糖的提取與測定,其對應含量如表3所示。

結果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢?？偟膩碚f,火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖。可以看出火棘中含有豐富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗中的3號樣品平行測定5次,結果表明,測定結果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測定3號樣品,連續(xù)測定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內穩(wěn)定。

3結論

本試驗以火棘為研究對象,探討了火棘中多糖的提取及含量測定。試驗結果表明,各因素的主次關系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見分光光度計測定火棘中多糖的含量?；鸺~中的多糖含量高于果實,火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關結果將為火棘資源開發(fā)利用提供參考。

參考文獻:

[1] 曾令貴,鐘露苗.火棘的研究現狀與應用概況[J].中國藥事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蔣利華,熊遠福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究進展[J].中國野生植物資源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李維熙,李怡芳,等.火棘果實提取物的美白作用[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(2):184-188.

[6] 吳立軍.天然藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988.

[7] 黃妮,熊雙麗,盧飛.綿麥冬多糖的分離純化及自由基清除活性[J].林產化學與工業(yè),2011,31(1):68-72.

[8] 李潤豐,常學東,陳雪娜.板栗多糖提取工藝的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(2):96-100.

[9] 莊永亮,孫麗平,尚小麗.紅托竹蓀菌蓋多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(3):45-49.

[10] 楊勝利,劉敏,錢俊青.香菇多糖酶催化酯化技術及其抗病毒活性研究[J].生物質化學工程,2009,43(4):29-32.

[11] 劉丹.對多糖測定方法的探討[J].四川文理學院學報,2008, 18(2):48-50.

2.2.2液料比對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,提取劑pH為5,60 ℃提取20 min,不同液料比對提取率的影響見圖4。由圖4可知,當液料比為30∶1時,多糖提取率最高。當液料比較小時,物料與提取液接觸不充分,導致提取率較低;而當液料比為30∶1至60∶1時,提取率較穩(wěn)定。

2.2.3提取時間對多糖提取率的影響稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比30∶1,提取劑pH為5,60 ℃超聲不同時間對多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知,隨著超聲時間的增加,多糖提取率升高。當提取溫度超過30 min后,提取率趨向穩(wěn)定。

2.2.4提取溫度對多糖提取率的影響 稱取6份樣品粉末,每份1.000 0 g,液料比為30∶1,提取劑pH為5,超聲時間20 ℃,不同溫度對多糖提取率的影響見圖6。由圖6可知,在30 ℃和80 ℃下,多糖提取率較高,30~40 ℃時,多糖提取率與溫度呈負相關,40~70 ℃時,多糖提取率與溫度呈正相關。

2.3正交試驗結果

為全面考察多糖提取的工藝參數,根據單因素試驗結果及相關文獻[7-10],以提取溫度、pH、提取時間及液料比4個因素進行正交試驗,采用L9(34)正交試驗方法以確定提取最佳條件,正交試驗設計及結果見表1。

由各因素極差分析可知,對多糖提取率的影響大小次序是A、B、C、D,即提取溫度>pH>提取時間>液料比。最佳方案是A1B3C2D2,即優(yōu)化條件為:液料比30∶1,在pH為7的條件下,30 ℃超聲提取40 min。

但該方案在正交試驗中并沒有出現,為了確定上述方案是否為最佳方案,按A1B3C2D2條件對火棘果樣品進行分析,結果見表2。從表2中可知,該方案可行。

2.4實際樣品分析結果

在上述A1B3C2D2條件下,對9~12月份火棘的葉和果進行了多糖的提取與測定,其對應含量如表3所示。

結果表明,9~12月,火棘葉中多糖含量逐漸變小,而火棘果中多糖從9~10月是逐漸增加的,從11月以后火棘果中的多糖呈下降趨勢?？偟膩碚f,火棘葉中的多糖大于火棘果中多糖?？梢钥闯龌鸺泻胸S富的多糖。

2.5精密度和穩(wěn)定性分析

吸取正交試驗中的3號樣品平行測定5次,結果表明,測定結果的RSD=2.16%,表明儀器精密良好;每隔10 min測定3號樣品,連續(xù)測定6次,其RSD為0.97%,表明樣品溶液在1 h內穩(wěn)定。

3結論

本試驗以火棘為研究對象,探討了火棘中多糖的提取及含量測定。試驗結果表明,各因素的主次關系為:提取溫度>提取劑酸堿度>提取時間>液料比;最佳提取工藝為:提取溫度30 ℃、pH為7,提取時間40 min、液料比30∶1,采用紫外-可見分光光度計測定火棘中多糖的含量。火棘葉中的多糖含量高于果實,火棘葉中的多糖在9~12月間逐漸變小,而果中多糖在9~10月間增加,11~12月間下降。相關結果將為火棘資源開發(fā)利用提供參考。

參考文獻:

[1] 曾令貴,鐘露苗.火棘的研究現狀與應用概況[J].中國藥事,2009,23(10):1021-1023.

[2] TETSUO K,JEFFREY B H,JOHN E,et al.Dibenzofuran phytoalexins from the sapwood tissue of photinia,pyracantha and cratategus species[J].Phytochemistry,1995,39(5):1033-1037.

[3] DAI Y,ZHOU G X,KURIHARA H,et al.Fortuneanosides G-l,dibenzofuran glycosides from the fruit of Pyracantha fortuneana[J].Chem Pharm Bull,2008,56(4):439-442.

[4] 蔣利華,熊遠福,李霞,等.野生火棘果有效成分研究進展[J].中國野生植物資源,2007,26(2):8-10.

[5] 何蓉蓉,李維熙,李怡芳,等.火棘果實提取物的美白作用[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(2):184-188.

[6] 吳立軍.天然藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988.

[7] 黃妮,熊雙麗,盧飛.綿麥冬多糖的分離純化及自由基清除活性[J].林產化學與工業(yè),2011,31(1):68-72.

[8] 李潤豐,常學東,陳雪娜.板栗多糖提取工藝的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(2):96-100.

[9] 莊永亮,孫麗平,尚小麗.紅托竹蓀菌蓋多糖的提取及抗氧化能力的研究[J].林產化學與工業(yè),2011,31(3):45-49.

[10] 楊勝利,劉敏,錢俊青.香菇多糖酶催化酯化技術及其抗病毒活性研究[J].生物質化學工程,2009,43(4):29-32.

[11] 劉丹.對多糖測定方法的探討[J].四川文理學院學報,2008, 18(2):48-50.