冉孝琴+桂陽+張麗娜+楊通靜+朱國勝

摘要：為了揭示烏天麻和紅天麻種子自然萌發(fā)和生長發(fā)育特性，建立野生萌發(fā)菌收集方法，采用4 ℃冷藏、室溫貯藏、新鮮種子3種不同貯藏方式的紅天麻和烏天麻種子在原生地播種，通過不同時間取樣，觀察統(tǒng)計種子的萌發(fā)率、死亡率和萌發(fā)生長指數(shù)。結(jié)果表明，天麻種子6月播種，8月有較高的萌發(fā)率，9月種子萌發(fā)生長指數(shù)高；不同貯藏方式下的天麻種子其萌發(fā)率、死亡率、生長指數(shù)差異顯著；常溫貯藏種子萌發(fā)生長指數(shù)顯著小于4 ℃冷藏種子與新鮮種子，4 ℃冷藏種子與新鮮種子之間萌發(fā)生長指數(shù)相近。因此在6月選擇新鮮種子或短時間冷藏種子播種有利于種子的萌發(fā)，在9月利于采樣，可以獲得理想的萌發(fā)菌分離材料。

關(guān)鍵詞：天麻（Gastrodia elata）；萌發(fā)菌；原生地；萌發(fā)率；萌發(fā)生長指數(shù)

中圖分類號：S682.31；Q945.34文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2325-05

The Natural Germination-Growth Characteristics of Gastrodia elata Seeds

RAN Xiao-qin1，2，GUI Yang2，ZHANG Li-na2，YANG Tong-jing2，ZHU Guo-sheng2

（1.College of Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China； 2.Institute of Modern Chinese Medicinal Materials，Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Guiyang 550006，China）

Abstract： To reveal the seed germination and growing characteristics of seeds of G. elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow and to establish the wild G. elata germinating fungi collection method， fresh seeds and seeds preservted under 4 ℃ or room temperature of G.elata f.elata and G.elata f.glauca S.Chow were sowned and sampled in situ. Methods of observation and statistics were used to study seed mortality rate，germination rate and germination-growth index.Results showed that seeds sowned in June had higher seed germination rate in August and higher germination- growth index in September.There were significant differences of germination rate，mortality rate and germination-growth index among seeds stored under three different temperature. Germination-growth index of seeds stored under room temperature was significant lower than that of fresh seeds and those stored under 4 ℃. There was no significant difference of germination-growth index between fresh seed and those stored under 4 ℃. Fresh seeds and seeds stored under 4 ℃ for 20 days were used to sow in June，good germinating fungi separation material could be collected in September.

Key words： Gastrodia elata；germinating fungi；in situ；germination rate；germination-growth index

基金項目：貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金項目[黔科合人字（2011）35號]；貴州省科技計劃項目[黔科合院所創(chuàng)能（2010）4002]；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動項目[黔農(nóng)科院人才啟動項目（2009）006號]

天麻（Gastrodia elata）為蘭科天麻屬（Gastrodia）多年生寄生草本，無根，無綠色葉片，不能進(jìn)行光合作用，營異養(yǎng)生活[1]。天麻全世界約有20種以上，分布于熱帶、亞熱帶、溫帶以及寒溫帶山地[2]。中國天麻屬植物已發(fā)現(xiàn)6個種，即天麻（G. elata）、原天麻（G. angusta）、細(xì)天麻（G. gracilis）、南天麻（G. javanica）、疣天麻（G. tuberculata）。天麻在西南地區(qū)大多生長于海拔700～2 800 m的闊葉落葉林山區(qū)[3，4]。天麻干燥塊莖具有平肝熄風(fēng)、止痙之功效，用于治療頭暈?zāi)垦?、小兒驚風(fēng)、癲癇、肢體麻木及半身不遂等癥[5，6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，天麻還具有增智、健腦和延緩衰老的作用，對老年性癡呆癥具有一定的療效[7，8]。因此，天麻越來越受到人們的關(guān)注。

由于生態(tài)環(huán)境的不斷破壞和人類大肆采挖，使得野生天麻資源日益減少，目前天麻已被列入國家重點保護野生植物名錄。天麻在中國普遍栽培，紅天麻和烏天麻為主栽品種。天麻種子小，發(fā)育不全，沒有胚乳，自身貯存的營養(yǎng)不能滿足其萌發(fā)和生長需要，需與小菇屬真菌共生才能正常萌發(fā)生長形成原球莖，但不同的小菇屬真菌對天麻種子萌發(fā)和生長的作用差異較大[9，10]。貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室人員在貴州天麻產(chǎn)區(qū)的調(diào)查結(jié)果也表明，不同天麻種子與不同萌發(fā)菌之間的親和性不同，同種萌發(fā)菌對同種天麻種子萌發(fā)和生長效果還受自然環(huán)境的影響，在實際生產(chǎn)中往往因萌發(fā)菌菌種與當(dāng)?shù)靥炻榉N子的親和性不高或不適宜當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境而導(dǎo)致空窩率高，最終影響到天麻有性繁殖的產(chǎn)量，很多產(chǎn)地不得不通過增加種子的數(shù)量來降低風(fēng)險，每平方米用種量最多的可達(dá)到25個蒴果，大大增加了成本[11]。為此搜集不同天麻產(chǎn)區(qū)萌發(fā)菌資源，選育出適宜不同區(qū)域不同種天麻的高親和性萌發(fā)菌菌株已成為減少蒴果用量、降低成本、提高效益的必由之路。Rasmussen等[12]建立的種子袋原生地播種技術(shù)使得回收微小蘭科植物種子成為可能，為蘭科植物種子在自然界中萌發(fā)特性研究提供了技術(shù)保障。目前，種子袋原生地播種法已成功應(yīng)用于多種蘭科植物種子自然萌發(fā)特性的研究，定期回收種子袋檢測種子的萌發(fā)情況，可調(diào)查種子的萌發(fā)啟動時間、種子萌發(fā)形態(tài)變化過程及種子在土壤中的存活時期[13-15]；可調(diào)查種子萌發(fā)與地點分布的相關(guān)性[16-18]；可誘捕共生菌，調(diào)查種子萌發(fā)與共生菌的相關(guān)性[19-21]。迄今為止，還沒有關(guān)于天麻種子原生地自然萌發(fā)特性和利用種子袋原生地共生萌發(fā)誘捕野生萌發(fā)菌的相關(guān)報道。本研究采用原生地種子袋播種法，將不同貯藏方式的天麻種子在原生地播種，并在不同時間取樣觀察種子萌發(fā)生長變化情況，總結(jié)出天麻種子自然萌發(fā)和生長發(fā)育特性，建立野生萌發(fā)菌收集方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料分別為紅天麻與烏天麻。采集授粉后20～21 d的蒴果，紅天麻蒴果顏色為橙紅色，烏天麻蒴果的顏色為橙黃色，成熟蒴果的六條縱縫明顯，手捏起來有點軟，可聽見微弱開裂的聲音。

1.2試驗設(shè)計

試驗設(shè)置3種不同的種子貯藏方式，以考察不同貯藏方式對種子播種后的影響，各貯藏方式分別為：①4 ℃冷藏種子。每種天麻各100粒蒴果，每25粒蒴果裝1信封中，蒴果開裂后，將果殼取出，信封不封口，放入冰箱4 ℃冷藏20 d備用。②常溫貯藏種子。同4 ℃冷藏種子采集方法，每25粒放在一個平皿內(nèi)，蒴果采下來一天就會開裂，開裂后將蒴果殼拿出，防止霉變，放置20 d備用。③新鮮種子。采集蒴果，不貯藏，立即用。

1.3試驗方法

1.3.1播種前種子質(zhì)量的檢測將4 ℃冷藏、室溫貯藏和新鮮的天麻種子分別取出，各自混合均勻，取適量種子加入1.5 mL離心管中的0.25 mL刻度處，加入1%TTC溶液1 mL，30 ℃黑暗靜置48 h后，用膠頭滴管吹打使種子混勻，混勻后吸取種子滴在載玻片中央，用吸水紙吸去染液，置于體視顯微鏡下，隨機挑選3個視野，觀察種子染色情況，有活力種子種胚被染成橙色或者粉紅色，無活力種子種胚不著色或染成黃色，分別計數(shù)每個視野的種子總數(shù)和有活力種子總數(shù)，并計算種子活力。種子活力=（有活力種子總數(shù)/統(tǒng)計種子總數(shù)）×100%[22]。每個樣品設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2原生地播種參考原生地播種法[12]，采用300目尼龍網(wǎng)（孔徑約為20 μm）制作成7 cm×8 cm網(wǎng)袋，一端開口，播種前分別將種子袋在去離子水中浸泡5 min，將蒴果種子混合均勻后，用小勺把種子從網(wǎng)袋開口端撒入，稀疏平鋪種子袋一層，約為1 000粒種子。于2012年6月24日在天麻野生分布區(qū)貴州省雷山縣方祥鄉(xiāng)落葉闊葉林中（108°12′50″E，26°25′59″N，海拔1 598.60 m，陽坡坡度5°～10°）進(jìn)行播種。將種子裝好后，扒開淺層腐殖土及落葉，到落葉與地面土壤接觸的那一層時，將種子袋水平鋪開，覆蓋腐殖土約15 cm，然后再蓋10 cm雜草保濕保溫。

1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析于2012年8月27日、9月20日、10月23日、11月19日、12月22日進(jìn)行取樣，將取出的種子袋裝入有泥土的袋子中帶回實驗室觀察。觀察時先用毛刷刷去種子袋表面泥土，打開種子袋置于體式鏡下，隨機挑選5個視野，分別計算每個視野的種子總數(shù)、死亡種子總數(shù)和萌發(fā)種子總數(shù)，并計算萌發(fā)率、死亡率和萌發(fā)生長指數(shù)。萌發(fā)率=（萌發(fā)種子總數(shù)/統(tǒng)計種子總數(shù)）×100%；死亡率=（死亡種子總數(shù)/統(tǒng)計種子總數(shù)）×100%；萌發(fā)生長指數(shù)=（N1+2N2+3N3+4N4）/（N0+N1+N2+N3+N4），其中N0是未萌發(fā)種子數(shù)，N1、N2、N3、N4是種子萌發(fā)階段1、2、3、4的種子數(shù)[23]。萌發(fā)生長指數(shù)能夠反映種子萌發(fā)后各階段原球莖的生長情況。運用SPSS 17.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，分析各因子對天麻種子自然萌發(fā)和生長的影響。

2結(jié)果與分析

2.1不同貯藏方式對天麻種子活力的影響

經(jīng)過TTC染色檢測有效種胚種子的活力，檢測結(jié)果（表1）表明，不同貯藏方式對種子活力的影響差異顯著，新鮮種子活力最高，其次是4 ℃冷藏種子，常溫貯藏種子活力最低。常溫貯藏的紅天麻種子與烏天麻種子活力分別降低到55.09%和55.37%，4 ℃冷藏的紅天麻種子和烏天麻種子活力分別降低到70.21%和69.54%，兩種天麻之間差異不顯著。

2.2天麻種子自然萌發(fā)過程

紅天麻、烏天麻兩種天麻種子在自然條件下，種子萌發(fā)率低、死亡率高，不同貯藏方式的兩種天麻種子經(jīng)歷了相同的變化過程：種胚正常、種胚變色（黑色、紅褐色）、種胚消解，變色種胚的種子失去了活力不能正常萌發(fā)，并最終消解。兩種天麻種子吸收水分都發(fā)育至種胚膨大階段，隨后大部分種子停止生長；少部分種子萌發(fā)生長（圖1）。根據(jù)天麻種子萌發(fā)過程中形態(tài)大小及結(jié)構(gòu)分化情況將天麻種子萌發(fā)生長發(fā)育過程劃分為5個階段[24，25]。天麻種子萌發(fā)的5個階段為種胚未變化（階段0）、種胚膨大而尚未突破種皮（階段1）、種胚膨大突破種皮（階段2）、種胚出現(xiàn)分生原基（階段3）、芽體形成（階段4），其中階段0的種子未萌發(fā)，階段1、2、3、4為種子已萌發(fā)。

2.3不同貯藏方式對天麻種子死亡率的影響

由表2可知，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月死亡率都呈上升趨勢，8月種子死亡率最低，12月種子死亡率最高。紅天麻種子在4 ℃冷藏和常溫貯藏下其各月死亡率差異均達(dá)到顯著水平，新鮮種子各月死亡率均較低；烏天麻新鮮種子各月死亡率差異均達(dá)到顯著水平，常溫貯藏種子死亡率除9月和10月間差異不顯著外，其他月份間差異也均達(dá)到顯著水平。此外，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子的死亡率在各月都是常溫貯藏種子死亡率顯著高于4 ℃冷藏種子和新鮮種子，4 ℃冷藏種子顯著高于新鮮種子。相同貯藏方式下的兩種天麻種子，除10月的常溫貯藏種子外，其他各貯藏方式下的烏天麻種子各月死亡率均高于紅天麻。

2.4不同貯藏方式對天麻種子萌發(fā)率的影響

由表3可知，3種不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月的萌發(fā)率總體呈下降趨勢，8月種子萌發(fā)率最高，12月種子萌發(fā)率最低。紅天麻種子在常溫貯藏條件下除10月和11月間種子萌發(fā)率差異不顯著外，其他月份間差異顯著，4 ℃冷藏種子和新鮮種子的萌發(fā)率各月間差異均達(dá)到顯著水平；3種不同貯藏方式的烏天麻種子在各月間的差異均達(dá)到顯著水平。此外，除紅天麻8月和11月4 ℃冷藏種子和新鮮種子差異不顯著外，其他月份兩種天麻均是4 ℃冷藏種子萌發(fā)率顯著高于新鮮種子，新鮮種子各月的萌發(fā)率顯著高于常溫貯藏種子。

2.5不同貯藏方式對天麻種子萌發(fā)生長指數(shù)的影響

由表4可知，不同貯藏方式的兩種天麻種子在8～12月的萌發(fā)生長指數(shù)變化趨勢一致，均呈先上升后下降的變化趨勢，9月萌發(fā)生長指數(shù)達(dá)到最高。此外，在相同貯藏條件下的兩種天麻種子，除8月和9月的4 ℃冷藏種子外，烏天麻種子各月萌發(fā)生長指數(shù)均高于紅天麻。兩種紅天麻種子各貯藏方式間差異也均達(dá)顯著水平。

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

天麻種子6月播種后，8月萌發(fā)率最高，9月萌發(fā)生長指數(shù)最高，12月死亡率最高；4 ℃冷藏有利于提高種子的萌發(fā)率。因此在6月選擇新鮮種子或短時間冷藏種子播種有利于種子的萌發(fā)，在9月利于采樣，可以獲得理想的萌發(fā)菌分離材料。

3.2討論

1）天麻種子在6月播種，8月萌發(fā)率高、死亡率低，9月種子萌發(fā)生長指數(shù)較高。這主要因為每年的5～7月是雨季，天麻原生地此時的空氣濕度在85%左右，土壤濕度在90%以上，這為種子的萌發(fā)提供了充足的水分；此時，天麻原生地平均氣溫在18～25 ℃之間，是種子最適萌發(fā)溫度；此時的溫濕度也是萌發(fā)菌最適合生長的條件[26]，所以此時的萌發(fā)菌能侵染充分吸水膨大的天麻種子與其形成共生體系，為其提供養(yǎng)分，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)和生長。

2）環(huán)境溫度和濕度是影響種子保存后種子活力的主要外因。在常溫常濕環(huán)境下種子劣變較快，主要是因為在常溫常濕條件下，種子種皮透性加大，種子體內(nèi)出現(xiàn)了大量的羥自由基及其衍生物和超氧陰離子，這些物質(zhì)的積累最終導(dǎo)致種子劣變和衰老速度加快[27]。本研究得出，天麻種子在常溫下貯藏其種子活力降低，這一結(jié)論與上述研究結(jié)果一致，是因為天麻等蘭科植物種子在常溫下種子種皮通透性加大。有研究者用超低溫和超干燥對蘭科植物種子保存做了研究，超低溫和超干燥都是為了抑制種子體內(nèi)酶活反應(yīng)，從而保證種子活力[28，29]。因此，在常溫下我們可以嘗試用干燥法處理天麻種子，既防止種子霉變又抑制種子體內(nèi)酶活反應(yīng)，從而保證種子活力。

3）幼嫩的原球莖在天麻生命整個過程中是最薄弱的環(huán)節(jié)，大量的個體會在早期因養(yǎng)分不足及外界環(huán)境因素的影響，如溫度、濕度、病蟲害等夭亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻種子死亡大多是在早期原球莖階段；此階段的原球莖種皮透性加大、種胚新陳代謝活躍，因沒有及時地與萌發(fā)真菌接觸形成共生獲得養(yǎng)分而饑餓，加上外界環(huán)境不利因素的影響導(dǎo)致原球莖抵抗環(huán)境能力弱而死亡。因此，在選擇播種樣地時，有針對性地選擇有野生天麻生長、生境通風(fēng)性好、落葉腐殖層透水透氣較好的樣地，將有助于降低種子死亡率。

4）蘭科植物種子在自然條件下萌發(fā)率很低，影響其萌發(fā)的因素有種皮機械阻力和透水透氣性差、種胚發(fā)育不完全、營養(yǎng)物質(zhì)過少以及存在抑制物質(zhì)[30]。在自然條件下，蘭科植物種子的萌發(fā)必須依靠真菌的侵染來完成，但萌發(fā)率非常低。天麻種子呈粉末狀，在顯微鏡下觀察，種子呈紡錘形，結(jié)構(gòu)比較簡單，由1層透明的種皮和1個種胚組成，需要真菌侵染為其提供養(yǎng)分才能萌發(fā)，因此在自然條件下，天麻種子萌發(fā)率很低。相關(guān)研究表明，成熟的蘭科植物種子采集后保存在4 ℃黑暗環(huán)境中，有助于打破種子的休眠，提高種子的萌發(fā)率[13，25，31]。本研究得出，天麻種子在4 ℃冷藏20 d后，種子的萌發(fā)率高于新鮮種子，這與上述研究結(jié)果一致，是因為天麻等蘭科植物種子在成熟的過程中種子生理和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，在生理上將形成休眠機制，在結(jié)構(gòu)上形成一層不滲透結(jié)構(gòu)[13，25]，因此打破種子休眠機制和不滲透結(jié)構(gòu)，提高種子萌發(fā)率是關(guān)鍵，選用低溫保存可以打破種子休眠機制，提高種子萌發(fā)率。

5）天麻野生資源保護撫育是根據(jù)天麻植物生長特性及對生態(tài)環(huán)境條件的要求，在其原生境或相似的環(huán)境中，通過人為的介入增加種群數(shù)量，從而保持群落生態(tài)平衡的一種方式。本研究得出，天麻種子在6月播種，8月有較低的死亡率和較高的萌發(fā)率，9月有較高的萌發(fā)生長指數(shù)，其生長周期較長，當(dāng)年可獲得次生原球莖，所以在天麻野生資源保護撫育時，可人為提早升溫讓天麻抽薹開花，在4～5月完成天麻種子播種，這樣天麻就有較長的生長周期，在當(dāng)年可得到更多的原球莖來分離萌發(fā)菌；同樣，在天麻有性繁殖栽培產(chǎn)業(yè)中可提前升溫，使天麻的生長周期比天麻正常抽薹開花種植多1～2個月，從而提高當(dāng)年的天麻產(chǎn)量。

本研究未對室內(nèi)溫度和濕度進(jìn)行測定，也沒有定期對保存種子進(jìn)行活力檢測，所以本次試驗結(jié)果不能說明天麻種子在自然狀態(tài)下種子活力變化規(guī)律，也不能說明天麻種子在自然條件下或生產(chǎn)上可允許保存的最長時間，所以用什么樣的條件保存天麻種子既能保證其種子活力，又能提高天麻種子萌發(fā)率，是值得研究的。

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