王莉+史鵬+丁文利+閆曉寧+陳衛(wèi)民

摘要：利用平板升華法從陜北王家川采油廠污染土壤中篩選出3株對菲具有降解活性的菌株F13、F14和FQ20，并對它們降解菲的特性及各種影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在菲濃度為50 mg/L的條件下，F(xiàn)13在39 ℃、pH為9、36 h后降解率達(dá)到最高值94%；F14在36 ℃、pH為11、36 h后降解率達(dá)到最高值89%；FQ20在36 ℃、pH為9、30 h后降解率達(dá)到最高值87%。根據(jù)形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，鑒定F13、F14、FQ20分別為分支桿菌（Mycobacterium vanbaalenii）、戴爾福特菌（Delftia tsuruhatensis）、敏捷食酸菌（Acidovorax facilis），其16S rDNA序列相似性分別為99.93%、99.27%和99.01%。

關(guān)鍵詞：生物降解；菲；多環(huán)芳烴

中圖分類號：X172文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2264-04

Isolation and Identification of Phenanthrene-degrading Bacteria and

Its Degradation Conditions

WANG Li，SHI Peng，DING Wen-li，YAN Xiao-ning， CHEN Wei-min

（College of Life Sciences， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： Phenanthrene-degrading bacteria F13， F14， FQ20 were isolated from heavy oil contaminated soil at Wangjiachuan oil production factory in the north of Shaanxi province by plating sublimation method. Their abilities for phenanthrene degradation were studied and the various influencing factors were analyzed. The results showed that phenanthrene （50 mg/L） degradation rate for F13 was 94% when pH was 9 after 36 hours rotary culture at 39 ℃. Phenanthrene（50 mg/L） degradation rate for F14 was 89% when pH was 11 after 36 hours rotary culture at 36 ℃. Phenanthrene（50 mg/L） degradation rate for FQ20 was 87% when pH was 9 after 30 hours rotary culture at 36 ℃. F13， F14， FQ20 were further identified as Mycobacterium vanbaalenii， Delftia tsuruhatensis and Acidovorax facilis by the 16S rDNA sequencing analysis. The sequence similarities of F13， F14， FQ20 were 99.93%， 99.27% and 99.01%， respectively.

Key words： biodegradation； phenanthrene； polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2012AA101403）

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）指含有一個以上苯環(huán)的芳香化合物，可分為芳香稠環(huán)型和芳香非稠環(huán)型，是煤、石油、木材、煙草、有機高分子化合物等有機物熱解或不完全燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)性碳?xì)浠衔?。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、化石燃料消耗量的日益增加和工業(yè)“三廢”的大量排放，環(huán)境中PAHs的分布量與日俱增，已經(jīng)廣泛存在于人類生活的自然環(huán)境中，如大氣、水體、土壤、作物和食品，目前已知的PAHs約有200多種。由于PAHs具有很強的致畸、致癌、致突變作用，極大地威脅著人類的健康，因此現(xiàn)在PAHs的監(jiān)測越來越受到人們的重視，也是各國優(yōu)先控制的一類污染物[1-3]。

菲是一種芳香稠環(huán)型PAHs，由3個苯環(huán)成一定角度聯(lián)結(jié)而成，兼具K區(qū)和灣區(qū)結(jié)構(gòu)，因而其抗降解能力很強，容易在土壤環(huán)境中富集，菲在土壤中的吸附對其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化和歸宿起著重要的作用。近年來隨著土壤PAHs的污染狀況越來越嚴(yán)重，菲的分布、來源、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及各種處理方法都成為了當(dāng)前的研究熱點之一。目前國內(nèi)外很多學(xué)者正致力于將PAHs作為碳源或能源，利用自然環(huán)境中特定的菌株或菌群對其降解，探明PAHs的生物降解機理和共代謝的方式，探索更有效的生物修復(fù)技術(shù)[4]。

本試驗通過對采自陜北王家川采油廠污染的土壤進(jìn)行富集培養(yǎng)，分離獲得了3株以菲為惟一碳源的高效降解細(xì)菌，并對其降解菲的特性及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了初步研究，為PAHs污染土壤環(huán)境風(fēng)險的科學(xué)評價、農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)和PAHs污染土壤微生物降解和修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試土壤樣品采自陜北王家川采油廠東二區(qū)附近受石油污染土壤，取地表及以下10 cm的土層。

1.1.2培養(yǎng)基分離純化培養(yǎng)基（無機鹽培養(yǎng)基，MS）[5]：（NH4） 2SO4 2 g/L，KH2PO4 2 g/L， Na2HPO4 2 g/L，F(xiàn)eCl3 0.02 g/L，自然pH；富集培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基（MS）+50 mg/L的菲；降解試驗所用培養(yǎng)基：配方同分離純化培養(yǎng)基（不含瓊脂）；菌種斜面保存培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，NR）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.2。

1.2試驗方法

1.2.1菲高效降解細(xì)菌的富集分離及菌懸液的制備[6] 取50 g土樣于250 mL菲降解培養(yǎng)基中，并加入50 mg/L的菲作為惟一碳源，28 ℃、140 r/min、遮光振蕩培養(yǎng)。7 d后取200 μL接種于相同的新鮮培養(yǎng)基，相同條件下再培養(yǎng)7 d，最后將培養(yǎng)物適當(dāng)稀釋，涂平板。本試驗采用平板升華法進(jìn)行選擇性分離，具體步驟如下：把接種后的平板倒扣到底部平鋪有固體菲的500 mL燒杯上，用封口膜將接口處密封，整體放到電爐上加熱（約至100 ℃），并在平板上方放置冰袋，使菲升華后遇平板冷卻附著其上，約5 min后取下平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，挑取能產(chǎn)生透明圈的單菌落純化。

1.2.2菌體生物量濃度的測定方法待測培養(yǎng)液中加入乙酸乙酯，于分液漏斗中充分振蕩，萃取。取下層菌體溶液，以不加菲的接菌培養(yǎng)液為空白對照，在600 nm下測定吸光度。

1.2.3菲降解效率的測定定時整瓶提取培養(yǎng)液，經(jīng)環(huán)己烷萃取，并用硅膠G薄層層析法分離，石油醚溶解提取后，在252 nm測定紫外吸光度，以菲標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出培養(yǎng)液中的菲濃度。菲降解率計算公式：

T=（A-B）/A×100%

式中T為降解率（%），A為未接菌降解試驗用培養(yǎng)基中菲濃度（mg/L），B為接菌培養(yǎng)后降解試驗用培養(yǎng)基（降解液）中菲濃度（mg/L）[7]。

1.2.4不同因素對F13、F14、FQ20降解菲效能的影響①不同時間的降解。菲質(zhì)量濃度為50 mg/L的降解培養(yǎng)基中，1%的接種量，pH為7、28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別于18、24、36、48、60、72和96 h后測定菲濃度和菌體生物量濃度，繪制生長曲線。②不同 pH 的降解。將菲質(zhì)量濃度為50 mg/L的降解培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3、5、6、7、8、9、11，在 1%的接種量，28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h后測定菲濃度和菌體生物量濃度，繪制生長曲線。③不同溫度的降解[8-10]。分別在28、30、36、39和42℃下，在1%的接種量，菲濃度為50 mg/L，pH為7、140 r/min 條件下，振蕩培養(yǎng)48 h后測定菲濃度和菌體生物量濃度，繪制生長曲線。

1.2.5分離菌株的鑒定①對菌株進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和革蘭氏染色檢驗。②總DNA的提?。汗┰嚲杲臃N于培養(yǎng)液中，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期，8 000 r/min離心收集菌體，用TE溶液（10 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗滌3次，溶菌酶破壁，蛋白酶處理，酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀，風(fēng)干，最后溶于雙蒸水中。用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白吸光值檢測DNA樣品的濃度和純度[11]。③菌株16S rDNA的PCR擴增、測序：以總DNA為模板，選用來源于E. coli 16S rDNA基因序列保守區(qū)域的兩段引物P1和P6為正向引物和反向引物，其中P1序列為5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，P6序列為5′-CGGGATCCTA-CGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共34個循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min，PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存[11]，測序工作由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。④16S rDNA序列數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。將16S rDNA的全序列與從GenBank（NCBI）中獲得的已知模式菌種進(jìn)行多重序列比較，用SeqPup 0.5軟件錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后用DNAstar和MEGA軟件包分析，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹，使用EzTaxon server 2.1比對測試菌株間16S rDNA序列的相似性值。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離篩選

將菌株經(jīng)過2次富集馴化，在附著菲的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選可形成明顯透明圈且透明圈較大的菌株為高降解活性菌，命名為F13、F14、FQ20。

2.2菌株對菲的降解效能

2.2.1時間對菲降解的影響由圖1可知，在接種72 h后菲降解率達(dá)到最高，F(xiàn)13、F14、FQ20降解率分別為66%、61%、60%。菌株F13和F14在接種后的48～60 h間生長最快，菌株FQ20在接種后的24～36 h間生長最快，推測該時期為相應(yīng)菌體生長的指數(shù)期，其后生長變得緩慢或者有所下降。

2.2.2pH對菲降解的影響分析圖2可知，3種菌株均在堿性環(huán)境下生長良好，F(xiàn)14在pH為11時，F(xiàn)13和FQ20在pH為9時，菌體濃度都達(dá)到相應(yīng)的最大值；F13和FQ20在pH為9時降解率達(dá)到最大，分別為86%和80%；F14在pH為11時達(dá)到最大值75%，而在酸性條件下幾乎無降解，說明該菌的適用pH范圍偏堿性。

2.2.3培養(yǎng)溫度對菲降解的影響由圖3可知，溫度為39 ℃時，菌株F13對菲的降解率最高，為88%；溫度為36 ℃時，菌株F14、FQ20對菲的降解率最高，分別為70%和81%。溫度影響菌株降解菲的因素可能有兩個方面，一方面環(huán)境溫度的變化會影響菌株的代謝速率，最適生長溫度下，菌體濃度高降解率隨之增加；另一方面隨著溫度的上升，菲的溶解度增大容易被菌體利用。

2.2.4最佳條件下菌株對菲的降解率如圖4為菌株在最佳條件下對菲的降解速率和菌體生物量OD600 nm。針對不同的菌株，將培養(yǎng)條件調(diào)至相應(yīng)的最佳降解條件，F(xiàn)13在39 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)36 h后降解率達(dá)到最高，為94%，菌體生物量OD600 nm為0.52；F14在36 ℃、培養(yǎng)基pH為11，培養(yǎng)36 h后，降解率達(dá)到最高，為89%，菌體生物量濃度為0.49；FQ20在36 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)30 h后，降解率達(dá)到最高，為87%，菌體生物量OD600 nm為0.58。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌落形態(tài)及革蘭氏染色菌株F13的菌落呈黃色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明。經(jīng)革蘭氏染色初步鑒定均為陽性菌。

2.3.216S rDNA序列測序結(jié)果分析將所獲得的DNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用SeqPup 0.5軟件錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后用DNAstar和MEGA軟件包分析，采用 Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），發(fā)現(xiàn)F13與Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，為99.93%；F14與Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，為99.27%；FQ20與Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，為99.01%。

3小結(jié)與討論

從菲污染的土壤中分離篩選高效降解菲的菌株，是開展菲污染土壤的生物修復(fù)的基礎(chǔ)[12]?；诖?，本研究從受石油嚴(yán)重污染的土壤中分離得到了3株對菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3種菌株的生長環(huán)境均偏堿性，對熱均有一定的耐受性。不同菌株對環(huán)境介質(zhì)的pH和溫度的最適要求存在差異，主要體現(xiàn)在對PAHs生物可利用性的改變程度和對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能酶活性上存在差異[12-15]。

菲在自然條件下的降解過程受多種環(huán)境因子和營養(yǎng)元素的協(xié)同影響。例如生物表面活性劑的存在能夠降低菲在環(huán)境中的毛細(xì)管張力從而促進(jìn)菲的溶解，提高微生物的利用率，從而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在著具有降解菲能力的不同屬的微生物，部分是難以人工培養(yǎng)的。應(yīng)該進(jìn)一步結(jié)合免疫培養(yǎng)法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每個屬降解菲的機理以及不同屬之間、屬與環(huán)境之間的相互作用。同時，進(jìn)一步考慮多底物的存在對PAHs的微生物利用方式及其共代謝現(xiàn)象，以便更好地進(jìn)行生物修復(fù)。近年來，采用細(xì)胞融合技術(shù)等遺傳工程手段將多種降解基因轉(zhuǎn)入同一微生物中是研究熱點，以期獲得基因工程菌使之具備廣譜性的降解能力，但提高這種基因工程菌存活能力的研究有待進(jìn)一步深入。

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2.2.4最佳條件下菌株對菲的降解率如圖4為菌株在最佳條件下對菲的降解速率和菌體生物量OD600 nm。針對不同的菌株，將培養(yǎng)條件調(diào)至相應(yīng)的最佳降解條件，F(xiàn)13在39 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)36 h后降解率達(dá)到最高，為94%，菌體生物量OD600 nm為0.52；F14在36 ℃、培養(yǎng)基pH為11，培養(yǎng)36 h后，降解率達(dá)到最高，為89%，菌體生物量濃度為0.49；FQ20在36 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)30 h后，降解率達(dá)到最高，為87%，菌體生物量OD600 nm為0.58。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌落形態(tài)及革蘭氏染色菌株F13的菌落呈黃色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明。經(jīng)革蘭氏染色初步鑒定均為陽性菌。

2.3.216S rDNA序列測序結(jié)果分析將所獲得的DNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用SeqPup 0.5軟件錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后用DNAstar和MEGA軟件包分析，采用 Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），發(fā)現(xiàn)F13與Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，為99.93%；F14與Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，為99.27%；FQ20與Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，為99.01%。

3小結(jié)與討論

從菲污染的土壤中分離篩選高效降解菲的菌株，是開展菲污染土壤的生物修復(fù)的基礎(chǔ)[12]。基于此，本研究從受石油嚴(yán)重污染的土壤中分離得到了3株對菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3種菌株的生長環(huán)境均偏堿性，對熱均有一定的耐受性。不同菌株對環(huán)境介質(zhì)的pH和溫度的最適要求存在差異，主要體現(xiàn)在對PAHs生物可利用性的改變程度和對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能酶活性上存在差異[12-15]。

菲在自然條件下的降解過程受多種環(huán)境因子和營養(yǎng)元素的協(xié)同影響。例如生物表面活性劑的存在能夠降低菲在環(huán)境中的毛細(xì)管張力從而促進(jìn)菲的溶解，提高微生物的利用率，從而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在著具有降解菲能力的不同屬的微生物，部分是難以人工培養(yǎng)的。應(yīng)該進(jìn)一步結(jié)合免疫培養(yǎng)法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每個屬降解菲的機理以及不同屬之間、屬與環(huán)境之間的相互作用。同時，進(jìn)一步考慮多底物的存在對PAHs的微生物利用方式及其共代謝現(xiàn)象，以便更好地進(jìn)行生物修復(fù)。近年來，采用細(xì)胞融合技術(shù)等遺傳工程手段將多種降解基因轉(zhuǎn)入同一微生物中是研究熱點，以期獲得基因工程菌使之具備廣譜性的降解能力，但提高這種基因工程菌存活能力的研究有待進(jìn)一步深入。

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2.2.4最佳條件下菌株對菲的降解率如圖4為菌株在最佳條件下對菲的降解速率和菌體生物量OD600 nm。針對不同的菌株，將培養(yǎng)條件調(diào)至相應(yīng)的最佳降解條件，F(xiàn)13在39 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)36 h后降解率達(dá)到最高，為94%，菌體生物量OD600 nm為0.52；F14在36 ℃、培養(yǎng)基pH為11，培養(yǎng)36 h后，降解率達(dá)到最高，為89%，菌體生物量濃度為0.49；FQ20在36 ℃、培養(yǎng)基pH為9，培養(yǎng)30 h后，降解率達(dá)到最高，為87%，菌體生物量OD600 nm為0.58。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1菌落形態(tài)及革蘭氏染色菌株F13的菌落呈黃色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明；菌株F14的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，透明；菌株FQ20的菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣齊整，不透明。經(jīng)革蘭氏染色初步鑒定均為陽性菌。

2.3.216S rDNA序列測序結(jié)果分析將所獲得的DNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，用SeqPup 0.5軟件錄入，數(shù)據(jù)經(jīng)編輯后用DNAstar和MEGA軟件包分析，采用 Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），發(fā)現(xiàn)F13與Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的相似性最高，為99.93%；F14與Delftia tsuruhatensis T7的相似性最高，為99.27%；FQ20與Acidovorax facilis DSM649的相似性最高，為99.01%。

3小結(jié)與討論

從菲污染的土壤中分離篩選高效降解菲的菌株，是開展菲污染土壤的生物修復(fù)的基礎(chǔ)[12]?；诖耍狙芯繌氖苁蛧?yán)重污染的土壤中分離得到了3株對菲具有高效降解能力的菌株F13、F14、FQ20。研究表明3種菌株的生長環(huán)境均偏堿性，對熱均有一定的耐受性。不同菌株對環(huán)境介質(zhì)的pH和溫度的最適要求存在差異，主要體現(xiàn)在對PAHs生物可利用性的改變程度和對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能酶活性上存在差異[12-15]。

菲在自然條件下的降解過程受多種環(huán)境因子和營養(yǎng)元素的協(xié)同影響。例如生物表面活性劑的存在能夠降低菲在環(huán)境中的毛細(xì)管張力從而促進(jìn)菲的溶解，提高微生物的利用率，從而提高菲的降解率[4，15，16]。

石油污染土壤中存在著具有降解菲能力的不同屬的微生物，部分是難以人工培養(yǎng)的。應(yīng)該進(jìn)一步結(jié)合免疫培養(yǎng)法，全面研究降解菲及其他PAHs的微生物，把握每個屬降解菲的機理以及不同屬之間、屬與環(huán)境之間的相互作用。同時，進(jìn)一步考慮多底物的存在對PAHs的微生物利用方式及其共代謝現(xiàn)象，以便更好地進(jìn)行生物修復(fù)。近年來，采用細(xì)胞融合技術(shù)等遺傳工程手段將多種降解基因轉(zhuǎn)入同一微生物中是研究熱點，以期獲得基因工程菌使之具備廣譜性的降解能力，但提高這種基因工程菌存活能力的研究有待進(jìn)一步深入。

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