趙春風，刁曉平,*，謝嘉，曹佳，宋芹芹，鄭鵬飛，王?；?/p>

1. 海南大學農(nóng)學院，?？?570228 2. 海南大學海口市環(huán)境毒理學重點實驗室，海口 570228 3. 海南大學環(huán)境與植物保護學院，?？?570228

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對馬氏珠母貝(Pinctada martensi)血細胞免疫功能及氧化應激效應的影響

趙春風1,2，刁曉平1,2,*，謝嘉2,3，曹佳1，宋芹芹1，鄭鵬飛1，王?；?

1. 海南大學農(nóng)學院，?？?570228 2. 海南大學海口市環(huán)境毒理學重點實驗室，?？?570228 3. 海南大學環(huán)境與植物保護學院，海口 570228

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是一種持久性的有機污染物(POPs)，具有潛在毒性、致癌性。選取馬氏珠母貝(Pinctada martensi)為研究對象，研究DEHP對其血淋巴細胞免疫功能和脂質(zhì)過氧化水平的影響。將成年馬氏珠母貝暴露于不同濃度(0.5、2.0、8.0、16.0 mg·L-1)的DEHP中，暴露14 d后測定血細胞數(shù)目(THC)、吞噬能力(phagocytic activity)、細胞膜穩(wěn)定性(cell membrane stability)、脂質(zhì)過氧化程度(LPO)和總谷胱甘肽含量(T-GSH)的變化。結(jié)果顯示，血細胞數(shù)目隨DEHP濃度的升高而降低，呈明顯的劑量-效應關(guān)系，最低可見效應濃度(LOEC)<0.5 mg·L-1。細胞膜穩(wěn)定性和吞噬活力均隨DEHP濃度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其LOEC值分別小于2和8 mg·L-1。細胞中丙二醛(MDA)含量隨染毒濃度增加逐漸升高，在8 mg·L-1濃度組達到最高值，之后降低，與之相應的脂質(zhì)過氧化水平也呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，LOEC<2 mg·L-1。8 mg·L-1濃度組的總谷胱甘肽含量與對照組相比存在顯著差異性(p<0.05)，LOEC<8 mg·L-1。研究結(jié)果表明：DEHP染毒14 d對馬氏珠母貝血淋巴細胞免疫功能有明顯的影響，同時還會誘導機體產(chǎn)生氧化應激效應，在所測試的指標中，血細胞計數(shù)對DEHP的脅迫最敏感(LOEC<0.5 mg·L-1)，細胞膜穩(wěn)定性和脂質(zhì)過氧化水平的敏感性次之(LOEC<2 mg·L-1)。

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)；馬氏珠母貝；血淋巴細胞；免疫功能；氧化應激

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(PAEs)，被廣泛用作增塑劑來提高多種塑料的柔軟性。其中，鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)因其價格低廉并具有穩(wěn)定性、流動性、不易揮發(fā)等特點而被廣泛使用[1]。同時，DEHP是環(huán)境內(nèi)分泌干擾素[2]，具有生殖毒性和免疫毒性等，且長期存在于環(huán)境中不易分解，因此中國環(huán)境檢測總站和美國國家環(huán)境保護局(USEPA)均將該類化合物列為優(yōu)先控制污染物[3-4]。

雙殼貝類已經(jīng)被廣泛用作環(huán)境標記物載體來檢測海洋環(huán)境污染[5-6]。雙殼貝類多棲息于濱海或河口地區(qū)，移動性差，活動范圍很小，營濾食性生活，代謝率低，對海洋有機污染物具有很強的生物富集作用[7-8]。因此，通過研究貝類機體的變化可以反映出近海岸帶生態(tài)環(huán)境的污染情況。國內(nèi)外研究DEHP對貝類的影響，多集中于DEHP的生殖毒性和胚胎毒性等方面，較少從免疫毒性方面開展DEHP對貝類的影響研究。

本研究選擇海南常見經(jīng)濟貝類馬氏珠母貝為實驗動物，研究DEHP脅迫對其血細胞非特異性免疫系統(tǒng)和抗氧化能力的影響，通過免疫和氧化損傷指標篩選出敏感的生物標志物，用于指示海洋環(huán)境中DEHP的污染程度，探討其免疫毒性機理和氧化損傷機制，并為防治DEHP對海洋環(huán)境的污染提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用馬氏珠母貝(Pinctada maetensi)購于海南省陵水縣毅珠貝類養(yǎng)殖場，貝齡為2 y，平均殼長6～7 cm。實驗用海水取自海南陵水黎安港無污染區(qū)域的自然海水，經(jīng)80目篩絹網(wǎng)過濾處理后待用。

1.2 儀器與試劑

儀器：VOSHIN96-IIL超聲波破碎儀(沃信儀器公司，中國)；96孔細胞培養(yǎng)板(Costar公司，美國)，Model 680型酶標儀(BIO-RAD公司，美國)，細胞培養(yǎng)箱(Olympus公司，日本)；恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設備，中國)，YX280B高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司，中國)，PHS—3B精密pH計(上海精密科學儀器有限公司，中國)，5702臺式冷凍低速離心機(Eppendorf公司，德國)。

試劑：NaCl，CaCl2，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，MgSO4，醋酸鈣，甲醛，乙酸，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，乙醇，丙酮(均為分析純)購自中國廣州化工集團；牛血清蛋白，BioRad試劑，2-硝基苯甲酸((DTNB)，50%(質(zhì)量分數(shù)) 三氯乙酸 (TCA)溶液，1%(質(zhì)量分數(shù)) 硫代戊巴比妥酸(TBA)溶液，中性紅(NR)染料，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均購自日本TCI公司；DEHP(Sigma公司，美國)為分析純。

磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2)的配制：8 g NaCl、2.0 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4和0.2 g KCl，用蒸餾水定容至1 L，必要時用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌，常溫保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 染毒方法

將馬氏珠母貝清洗干凈后清除貝體表面附著物，在盛有新鮮海水(鹽度為32‰，pH值為8.3，溫度為28 ℃～33 ℃)的水槽中馴養(yǎng)3 d，連續(xù)通氣，每日投喂金藻并換水。馴養(yǎng)結(jié)束后，選取殼長6～7 cm的健康個體進行染毒。

將選好的貝分別養(yǎng)于50 cm×30 cm×40 cm的玻璃水槽中，每只水槽10 L水，放置12只馬氏珠母貝。根據(jù)預實驗結(jié)果，以丙酮作為助溶劑(體積百分比小于1%)，以海水配制成400、800、1 600、3 200 μg·mL-1的母液，然后取1 mL加入水槽中配成0.5、2、8、16 mg·L-1實驗溶液，同時設置丙酮對照組。對照組及實驗處理組均設置3個平行。連續(xù)通氣，每天換水，分別在染毒后14 d取樣。

1.3.2 樣品的采集

每個平行組分別取3只貝，用1 mL一次性注射器從閉殼肌旁的血竇中抽取血細胞，合并裝于EP管中，用改良的Alsever溶液做抗凝劑抗凝，并用PBS緩沖液調(diào)節(jié)細胞密度為1×106cell·mL-1，-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 指標檢測

對馬氏珠母貝的血淋巴細胞進行以下幾個指標的檢測：血細胞計數(shù)(total haemocyte count, THC)，蛋白質(zhì)的濃度(protein concentration)，細胞膜的穩(wěn)定性(cell membrane stability)，吞噬活性(phagocytosis)以及脂質(zhì)過氧(LPO)化水平。

1.4.1 血細胞計數(shù)

取血細胞樣品與甲醇鈣溶液(BFC，含質(zhì)量分數(shù)為2%的NaCl，質(zhì)量分數(shù)為1%的醋酸鈣，質(zhì)量分數(shù)為4%的甲醛)以血細胞∶BFC=1∶4的比例進行稀釋，并固定細胞。用25×16格細胞計數(shù)板在普通顯微鏡下(40×15倍)觀察中央計數(shù)區(qū)，計算血細胞數(shù)目。

1.4.2 蛋白質(zhì)濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度用改良的考馬斯亮藍法[9]來測定。將樣品用生理鹽水(0.02 mol·L-1HEPES，0.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1MgSO4，0.01 mol·L-1KCl，0.01 mol·L-1CaCl2；pH7.4)4倍稀釋，取5 μL加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，同時做標準(0.2～1.0 mg·mL-1牛血清蛋白)組和陰性對照組(生理鹽水)；然后往樣品和對照組中加入200 μL稀釋后的BioRad試劑(蒸餾水6倍稀釋)。做3個重復。20 ℃反應20 min，用酶標儀在595 nm的波長下測OD值。

1.4.3 細胞膜穩(wěn)定性的測定

采用改良的中性紅(NR)法檢測馬氏珠母貝血細胞穩(wěn)定性[10]。具體步驟：首先，將50 μL血細胞樣品加入細胞培養(yǎng)板中，4 ℃培養(yǎng)45 min，然后用生理鹽水將未凝集的細胞洗去；加入200 μL質(zhì)量分數(shù)為0.004%的NR溶液，室溫下培養(yǎng)3 h，待吞噬后，將多余的NR染料用生理鹽水洗去；隨后加入200 μL的酸化乙醇進行脫色。用酶標儀在550 nm吸收波長下，測定各孔OD值。

1.4.4 吞噬活性的測定

通過檢測血細胞對中性紅(NR)染色的酵母多糖的吞噬活力來測定吞噬活性。具體步驟：血細胞樣品在冰上解凍，接著取50 μL加入細胞培養(yǎng)板中，4 ℃培養(yǎng)1 h，用生理鹽水洗去未凝集的細胞；然后加入50 μL已被NR染色的酵母多糖懸液(50×107mL-1)常溫下培養(yǎng)30 min；隨后將多余的酵母多糖顆粒用生理鹽水洗去，加入100 μL BFC固定細胞，再加100 μL的酸化乙醇進行脫色。用酶標儀在550 nm吸收波長下，測定各孔OD值。

1.4.5 脂質(zhì)過氧化程度的測定

實驗采用改良的硫代巴比妥酸(TBARS)法[11]進行檢測。具體步驟：血細胞樣品在冰上解凍，然后取40 μL加入到細胞培養(yǎng)板中，加入10 μL BHT(1 mmol·L-12,6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶解在乙醇中)，以防止進一步脂質(zhì)過氧化；隨后加入100 μL提取液(20 mmol·L-1Tris-chloride，0.15 mol·L-1KCl，0.5 mol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸；pH 7.6)，緊接著加入50 μL 50%的TCA溶液和75 μL 1%的TBA溶液；60 ℃水浴60 min后冰上降溫，用酶標儀在550 nm吸收波長下，測定各孔OD值，結(jié)果用丙二醛(MDAe)含量表示。

1.4.6 總谷胱甘肽(T-GSH)含量的測定

采用DTNB法測定總谷胱甘肽(GSH+GSSG)的含量[12]。取血細胞樣品200 mL，4 ℃離心5 min后棄掉上清，剩下的細胞用生理鹽水重懸。采用超聲波破碎儀將細胞破碎，-80 ℃保存?zhèn)溆?。實驗時，將樣品置于冰上解凍，接著用移液器吸取80 μL樣品與40 μL DTNB溶液(10 mmol·L-1DTNB，100 mmol·L-1KH2PO4，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸)混合，用DTNB對樣品進行預處理。然后取40 μL被DTNB處理過的樣品加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，然后往樣品中加入210 μL谷胱甘肽還原酶液(2.06 U·mL-1谷胱甘肽還原酶，100 mmol·L-1KH2PO4，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸；pH 7.5)。平衡1 min，然后加入60 μL 1 mmol·L-1乳醛還原酶(NADPH)溶液，反應1 min。用酶標儀在405 nm波長下測定樣品的OD值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗組作6次重復，結(jié)果以Mean±SEM表示，并用采用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(Duncan)，其中獨立樣本數(shù)n=3，對各濃度組與對照組數(shù)據(jù)進行差異性顯著分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對血細胞數(shù)量的影響

如圖1所示，隨染毒濃度的增加，馬氏珠母貝血細胞數(shù)量呈遞減趨勢，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關(guān)系，其最低可見效應濃度(LOEC) <0.5 mg·L-1，即從0.5 mg·L-1濃度組血細胞數(shù)量(5.02×106cell·mL-1)與對照組(8.77×106cell·mL-1)相比，存在顯著差異(p<0.05)；8 mg·L-1濃度組的血細胞數(shù)與對照組相比呈極顯著差異(p<0.01)；16 mg·L-1濃度組血細胞數(shù)量最少為1.25×106cell·mL-1，與對照組相比，減少了86%。

2.2 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對血細胞膜穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，血細胞膜的穩(wěn)定性隨DEHP暴露濃度的升高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當染毒濃度為2.0 mg·L-1時，細胞膜穩(wěn)定性最高，其OD550達到4.16 mg-1prot，與對照組(3.61 mg-1prot)相比出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。然后隨著染毒濃度的增高，OD550值逐漸降低，到染毒濃度達16.0 mg·L-1時降至最低，與對照組水平，降幅達到54%，但與對照組相比，并沒有表現(xiàn)顯著差異性(p>0.05)。

2.3 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對血細胞細胞吞噬活力的影響

從圖3中可以看出，起初隨著DEHP濃度的增加，細胞吞噬活性也隨之增強，當染毒濃度達到8.0 mg·L-1時，與對照組相比，出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，細胞吞噬酵母聚糖顆粒的OD550值為3.21 mg-1prot，LOEC<8.0 mg·L-1。當濃度達到16.0 mg·L-1時，吞噬作用有減弱，與對照組相比，無顯著性差異(p>0.05)。

2.4 DEHP對血細胞脂質(zhì)過氧化水平的影響

DEHP對馬氏珠母貝血細胞脂質(zhì)過氧化水平的影響如圖4所示。隨DEHP濃度的升高，細胞中MDA含量隨之逐漸升高。當染毒濃度達到2.0 mg·L-1時，細胞中MDA含量與對照組相比，存在顯著差異性(p<0.05)，其LOEC<2.0 mg·L-1。染毒濃度達到8 mg·L-1時，MDA含量最高。當染毒濃度為最高值(16 mg·L-1)時，MDA含量出現(xiàn)下降趨勢，但與對照組相比無顯著差異(p>0.05)。

圖1 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d 對馬氏珠母貝血細胞數(shù)量(THC)的影響注：* p<0.05，** p<0.01，與對照相比，下同。Fig. 1 Total haemocyte counts (THC) of Pinctada martensi after exposure to diethylhexyl phthalate (DEHP) for 14 dNote: * p<0.05, ** p<0.01, compared with the control, the same below.

圖2 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對 馬氏珠母貝血細胞膜穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Haemocyte membrane stability of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

圖3 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對 馬氏珠母貝血細胞吞噬活力的影響Fig. 3 Phagocytic activity of haemocyte of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

圖4 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)DEHP染毒14 d對 馬氏珠母貝血細胞脂質(zhì)過氧化水平(LPO)的影響Fig. 4 Lipid peroxidation (LPO) of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

2.5 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對血細胞總谷胱甘肽(T-GSH)含量的影響

DEHP脅迫誘導血細胞產(chǎn)生氧化應激效應的結(jié)果見圖5。起初隨染毒濃度的升高，血細胞的總谷胱甘肽(T-GSH)含量呈逐漸遞增的趨勢，其中8 mg·L-1濃度組含量最高，為16.04 nmol·mg-1prot，與對照組(11.30 nmol·mg-1prot)相比，有明顯差異(p <0.05)，LOEC<8 mg·L-1。當染毒濃度為最高值(16 mg·L-1)時，T-GSH含量明顯下降，但與對照組相比沒有顯著差異(p >0.05)。

3 討論(Discussion)

DEHP來源主要通過3個途徑[13]：含有該物質(zhì)的廢水的直接排放，固體廢棄物緩慢釋放經(jīng)雨水淋溶后，進入地下水和地表水；間接途徑是首先進入大氣，經(jīng)沉降或雨水進入水環(huán)境中；另外，還有垃圾及其滲透液。進入水環(huán)境的DEHP會通過江河匯流及地下水滲透，最終進入海洋生態(tài)系統(tǒng)，從而對近海岸生態(tài)系統(tǒng)造成極大的影響[14]。有關(guān)研究報道DEHP具有生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性[15]。

本實驗研究了DEHP對馬氏珠母貝免疫功能的影響。血細胞計數(shù)實驗中，隨著染毒濃度的升高，血細胞數(shù)目也隨之減少，與對照組相比，0.5、2.0、8.0和16.0 mg·L-1這4個濃度組的血細胞數(shù)目分別減少了43%、52%、67%和86%。血細胞參與機體的各種反應，包括氣體交換，滲透調(diào)節(jié)，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和分配，代謝廢物的排泄以及損傷修復等，在貝類的先天免疫機制中起到至關(guān)重要的作用[16-17]。所以，血細胞數(shù)量的下降，可能是由于DEHP抑制了血細胞的產(chǎn)生或減少了其在組織中的釋放，從而導致免疫系統(tǒng)的功能減弱。解瑋等[18]研究DEHP內(nèi)分泌干擾活性時發(fā)現(xiàn)，DEHP可升高乳腺癌細胞(MCF-7)的雌激素受體(ERs)水平，得出了一定劑量水平的DEHP具有雌激素活性的結(jié)論。有研究表明17β-雌二醇以劑量依賴方式誘導Jurkat淋巴細胞發(fā)生凋亡[19]。張修武等[20]也發(fā)現(xiàn)雌二醇能夠誘導小鼠腹腔巨噬細胞發(fā)生典型細胞凋亡。本研究也得到了相似的結(jié)果，即馬氏珠母貝的血細胞數(shù)量隨DEHP染毒濃度升高逐漸減少，存在明顯的劑量-效應關(guān)系，其中LOEC<0.5 mg·L-1。馬氏珠母貝血細胞數(shù)量對DEHP的毒性脅迫有著明顯的響應?？梢酝茰y出無脊椎動物的非特異性免疫細胞在DEHP脅迫下，與雌激素刺激脊椎動物所產(chǎn)生的影響相似。其作用機理還有待進一步研究。

圖5 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對 馬氏珠母貝血細胞總谷胱甘肽(T-GSH)含量的影響Fig. 5 Total glutathione concentration (T-GSH) of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

對外源物質(zhì)的吞噬作用主要通過膜的變形功能得以實現(xiàn)，而細胞膜的穩(wěn)定性改變，會影響膜的變形功能，進而使吞噬活力改變。本研究中的吞噬活力和細胞膜穩(wěn)定性變化趨勢相同，在一定濃度范圍內(nèi)，活性增強，而當濃度達到較高時，活力下降。貝類中存在類IL-1α、IL-1β、IL-2樣細胞因子，且其功能與高等動物的相似[21]。低濃度的DEHP脅迫，可促進IL-1β的分泌，進而激活炎癥反應[22]，吞噬活力隨之增強。當高濃度的DEHP脅迫時，脂溶性污染物DEHP能夠與細胞膜結(jié)合，改變細胞膜的流動性和細胞膜上離子泵，導致細胞膜穩(wěn)定性降低，并且能夠阻礙血細胞變形運動，降低其吞噬活性[23-24]。Watanuki等報道了DEHP對鯉魚前腎白細胞的影響，發(fā)現(xiàn)中劑量濃度組(10和100 nmol·L-1)能使細胞的吞噬活力增強，而高濃度的DEHP(1 000 nmol·L-1)能引起吞噬活力下降[25]。筆者的研究也得到類似的結(jié)果。而在本研究中，血細胞數(shù)減少與吞噬活性增強同時發(fā)生。這一點與雌二醇對免疫系統(tǒng)的影響的研究結(jié)果相似。如袁文丹等[26]發(fā)現(xiàn)雌二醇有免疫增強和免疫抑制的雙重功效，隨時間、劑量的大小而變化，在較高劑量雌激素可引起腹腔巨噬細胞吞噬功能抑制，在低劑量時，雌激素可增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力。因此可以推測DEHP也通過類似的途徑作用于貝血細胞，導致血細胞數(shù)減少和吞噬功能增強同時存在。

MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低可指示生物膜脂質(zhì)過氧化的程度，目前已較多地應用于水生生態(tài)毒理學研究。DEHP在體內(nèi)代謝迅速降解為其單酯形式(MEHP)和其他產(chǎn)物，并產(chǎn)生了引發(fā)脂質(zhì)過氧化的自由基，這些自由基攻擊生物膜使氧化速率加快，從而導致脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，產(chǎn)生MDA等一系列對機體有害的產(chǎn)物。紀靚靚等[27]也發(fā)現(xiàn)污染物能促進自由基的產(chǎn)生，使抗氧化酶活性改變，MDA含量極顯著升高。本研究也獲得相似的結(jié)果，在DEHP脅迫下，血細胞中MDA含量隨濃度增加而上升，達到最高濃度時略有下降。血細胞中LPO水平的升高，表明DEHP脅迫使貝體內(nèi)氧自由基迅速增加，抗氧化防御體系僅能清除出部分自由基，從而緩解其對貝類造成的部分損傷，余下未能及時清除的自由基對細胞產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的損害，導致機體LPO水平升高。

谷胱甘肽(GSH)是機體的主要抗氧化劑之一，GSH分子中的巰基(-SH)能中和活性氧自由基，在谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的作用下將過氧化氫(H2O2)還原成H2O。當貝類受到DEHP脅迫時，貝體中發(fā)生代謝反應產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，引發(fā)機體氧化應激效應。本實驗中表現(xiàn)為隨著DEHP濃度的增加，T-GSH含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這與李麗萍等[28]研究DEHP誘導大鼠睪丸能量代謝酶的結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明谷胱甘肽合成對DEHP誘導產(chǎn)生的活性氧自由基有積極的抵抗作用，從而有助于增強貝體對DEHP毒害效應的抵御能力。綜上所述，DEHP污染會導致馬氏珠母貝免疫功能發(fā)生變化并誘導氧化應激效應。

DEHP脅迫會破壞馬氏珠母貝體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)并使貝體的免疫功能發(fā)生變化。馬氏珠母貝血細胞的數(shù)量對DEHP的脅迫最敏感，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應關(guān)系，LOEC<0.5 mg·L-1；DEHP的脅迫對細胞膜的穩(wěn)定性和血細胞的吞噬活性也有一定的影響，前者比后者更加敏感。DEHP污染還會誘導馬氏珠母貝產(chǎn)生氧化應激效應，表現(xiàn)為貝體內(nèi)總GSH以及MDA含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。研究結(jié)果表明：監(jiān)測DEHP對貝類血細胞免疫系統(tǒng)的變化及氧化損傷情況，可以作為生物指示物用于指示海洋中DEHP的污染程度，并為毒理機制研究提供依據(jù)。

[1] Staples C A, Peterson D R, Parkerton T F, et al. The environmental fate of phthalate esters: A literature review [J]. Chemosphere, 1997, 35(4): 667-749

[2] Jobling S, Reynolds T, White R, et a1. A variety of environmentally persistent chemicals, including some phthalate plasticizers, are weakly estrogenic [J]. Environmental Health Perspectives, 1995, 103(7): 582-587

[3] 金相燦. 有機化合物污染化學-有毒有機物污染化學[M]. 北京: 清華大學出版社, 1990: 266-275

[4] US Environmental Protection Agency. National Primary Drinking Water Regulations, Federal Register, 40 CFR Chapter I, Part 141 [S]. Washington DC: US Environmental Protection Agency, 1991

[5] Soto M, Marigomez I. Metal bioavailability assessment in Mussel-Watch programmes by automated image analysis of BSD in digestive cell lysosomes [J]. Marine Ecology Progress Series, 1997, 156: 141-150

[6] Orbea A, Garmendia L, Marigomez I, et al. Effects of the 'Prestige' oil spill on cellular biomarkers in intertidal mussels: Results of the first year of studies [J]. Marine Ecology Progress Series, 2006, 306: 177-189

[7] Cajaraville M P, Bebianno M J, Blasco J, et al. The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula: A practical approach [J]. Science of Total Environment, 2000, 247(2-3): 295-311

[8] 潘魯清, 劉娜, 王靜. 櫛孔扇貝在B[a]P脅迫下生物標志物篩選的研究[J]. 水生生物學報, 2012, 36(2): 299-306

Pan L Q, Liu N, Wang J. Study of biomarkers selection of the scallop Chlamys farreri exposed to B[A]P [J]. Acta Hydrobiolgica Sinica, 2012, 36(2): 299-306 (in Chinese)

[9] Bradford M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1-2): 248-254

[10] Hannam M L, Bamber S D, Sundt R C, et al. Immune modulation in the blue mussel Mytilus edulis exposed to North Sea produced water [J]. Environmental Pollution, 2009, 157(6): 1939-1944

[11] Camejo G, Wallin B, Enojarvi M. Free Radical and Antioxidant Protocols-Analysis of Oxidation and Antioxidants Using Microtiter plates [M]. Methods in Molecular Biology, 1998: 377-387

[12] Owens C W I, Belcher R V. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione [J]. Biochemical Journal, 1965, 94(3): 705-711

[13] 胡雄星, 韓中豪, 劉必寅, 等. 鄰苯二甲酸酯的毒性及其在環(huán)境中的分布[J]. 環(huán)境科學與管理, 2007, 32(1): 37-40

Hu X X, Han Z H, Liu B Y, et al. Distrubution of phthalic acid esters in environment and its toxicity [J]. Environmental Science and Management, 2007, 32(1): 37-40 (in Chinese)

[14] Deutschle T, Reiter R, Butte W, et al. A controlled challenge study on di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in house dust and the immune response in human nasal muscosa of allergic subjects [J]. Environmental Health Perspectives, 2008, 116(11): 1487-1494

[15] 高峰, 張琨, 吳曉剛, 等. 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯毒性作用[J]. 職業(yè)與健康, 2011, 27(17): 2019-2020

Gao F, Zhang K, Wu X G, et al. Study on toxicity of di-(2-ethylhexyl) phthalate [J]. Occupation and Health, 2011, 27(17): 2019-2020 (in Chinese)

[16] Cheng T C, Bivalves R. Invertebrate Blood Cells [M]. London: Academic Press, 1981: 233-300

[17] Shumway E S, Parsons J G. Scallops: Biology, Ecology and Aquaculture [M]. Amsterdam: Elsevier, 2006,: 123-227

[18] 解瑋. 某市供水體系有機提取物內(nèi)分泌干擾活性與鄰苯二甲酸二乙基己酯性激素干擾效應研究[D]. 上海: 復旦大學, 2004: 50-61

Xie W. Study on the endocrine disrupting effects of organic extracts from drinking water in a Chinese city and sex hormone disrupting effects caused by di(2-ethylhexyl)phthalate [D]. ShangHai: Fudan University, 2004: 50-61 (in Chinese)

[19] Jenkins J K, Suwarmaroj S, Elbourne K B, et a1. 17-β-Estradiol alters Jurkat lymphocyte cell cycling and induces apoptosis through suppression of Bcl-2 and cyclin A [J]. International Immunopharmacology, 2001, 1(11): 1897-1911

[20] 張修武, 牛喜林, 郭兆貴. 雌二醇誘導小鼠腹腔巨噬細胞程序性死亡[J]. 免疫學雜志, 1997, 13(1): 14-16

Zhang X W, Niu X L, Guo Z G. Estradiol induces apoptosis in mouse peritoneal macrophages [J]. Immunological Journal, 1997, 13(1): 14-16 (in Chinese)

[21] Enzo O, Antonella F, Stefano C. Cytokines and invertebrate immune responses [J]. Biology Cell, 1995, 85(1): 87-91

[22] 王佳, 孫霞, 董四君. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對THP-1細胞IL-1β和MMP-8表達及ROS的影響[J]. 生態(tài)毒理學報, 2013, 8(3): 350-356

Wang J, Sun X, Dong S J. Effects of DEHP on expression of IL-1β and MMP-8 and ROS production in THP-1 cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(3): 350-356 (in Chinese)

[23] Grundy M M, Moore M N, Howell S M, et al. Phagocytic reduction and effects on lysosomal membranes by polycyclic aromatic hydrocarbons, in haemocytes of Mytilus edulis [J]. Aquatic Toxicology, 1996, 34(4): 273-290

[24] Camus L, Jones M B, Borseth J F, et al. Total oxyradical scavenging capacity and cell membrane stability of haemocytes of the Arctic scallop, Chlamys islandicus, following benzo (a) pyrene exposure [J]. Marine Environmental Research, 2002, 54(3): 425-430

[25] Hironobu W, Yoshiki G, Masahiro S. In vitro modulation of common carp (Cyprinus carpio L.) phagocytic cells by di-n-butyl phthalate and di-2-ethylhexyl phthalate [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 63(2): 119-126

[26] 袁文丹, 崔勇, 劉巍, 等. 17β一雌二醇對大鼠腹腔巨噬細胞免疫活性影響[J]. 濟寧醫(yī)學院學報, 2007, 30(4): 296-298

Yuan W D, Cui Y, Liu W, et al. Effects of 17β-estradiol on immunocompetence of peritoneal macrophages of rat in vitro [J]. Journal of Jining Medical College, 2007, 30(4): 296-298 (in Chinese)

[27] 紀靚靚, 李法云, 羅義, 等. 2,4,6-三氯苯酚誘導鯽魚肝臟自由基的產(chǎn)生及其氧化應激[J]. 應用生態(tài)學報, 2007, 18(1): 129-132

Ji L L, Li F Y, Luo Y, et al. Free radicals in Carassius auratus liver: Their generation and oxidative stress induced by 2,4,6-trichlorophenol [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2007, 18(1): 129-132 (in Chinese)

[28] 李麗萍, 劉秀芳, 寧艷花, 等. DEHP對大鼠睪丸能量代謝酶的影響及其氧化損傷作用[J]. 寧夏醫(yī)科大學學報, 2010, 32(1): 74-77

Li L P, Liu X F, Ning Y H, et al. Effects of DEHP on rat testicular enzymes of energy metabolism and its role in oxidative damage [J]. Journal of Ningxia Medical University, 2010, 32(1): 74-77 (in Chinese)

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EffectsofDiethylhexylPhthalateonHaemocyteImmuneFunctionsandOxidativeStressinPinctadamartensi

Zhao Chunfeng1,2, Diao Xiaoping1,2,*, Xie Jia2,3, Cao Jia1, Song Qinqin1, Zheng Pengfei1, Wang Haihua1

1. College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China 2. Haikou Key Laboratory of Environment Toxicology, Hainan University, Haikou 570228, China 3. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China

12 November 2013accepted15 January 2014

Diethylhexyl phthalate (DEHP) is one of persistent organic pollutants (POPs), and poses a significant risk for carcinogenicity, teratogenicity and mutagenicity. In this study, changes of total haemocyte counts (THC), cell membrane stability, phagocytic activity and oxidative stress parameters, including lipid peroxidation (LPO) and total glutathione (T-GSH), of haemocytes of Pinctada martensi were measured in the haemolymph after exposure to different concentrations of DEHP (0.5, 2, 8 mg·L-1) for 14 days. The results showed that THC decreased while DEHP concentrations increased, showing an apparent negative dose-response curve. The lowest-observed-effect concentration (LOEC) for THC decrease was lower than 0.5 mg·L-1. Besides, cell membrane stability, phagocytic activity and lipid peroxidation level were reduced after a short-time rise with increasing DEHP concentration, showing an inverted U-shaped curve with LOEC value <2 mg·L-1, <8 mg·L-1and <2 mg·L-1, respectively. The T-GSH content in 8 mg·L-1group showed significant difference compared with the control group (p<0.05), with LOEC value <8 mg·L-1. It is indicated that 14 d-exposure to DEHP had significantly negative effect on the immune functions of haemocytes, and could induce oxidative stress in Pinctada martensii. The THC was the most sensitive indicator to the exposure of DEHP, followed by cell membrane stability and lipid peroxidation level.

diethylhexyl phthalate; Pinctada martensi; haemocyte; immune function; oxidative stress

海南省科技興海項目(XH201309);海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2012-1)

趙春風(1989-)，男，碩士，研究方向為生態(tài)毒理學，E-mail: zhao.c.f-2008@163.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: diaoxip@hainu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130722002

趙春風，刁曉平，謝嘉，等. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對馬氏珠母貝(Pinctada martensi)血淋巴細胞的免疫功能及氧化應激效應的影響[J]. 生態(tài)毒理學報, 2014, 9(2): 375-381

Zhao C F, Diao X P, Xie J, et al. Effects of diethylhexyl phthalate on haemocyte immune functions and oxidative stress in Pinctada martensi [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 375-381 (in Chinese)

2013-11-12錄用日期2014-01-15

1673-5897(2014)2-375-07

X171.5

A

刁曉平(1963—)，女，生態(tài)學博士，教授，主要研究方向為生態(tài)毒理學和污染生態(tài)學，發(fā)表學術(shù)論文30余篇。