劉麗，鐘文玨，祝凌燕

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室 天津市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與防治重點實驗室，天津300071

沉積物中六氯苯對搖蚊幼蟲的慢性毒性效應(yīng)

劉麗，鐘文玨，祝凌燕*

南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室 天津市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與防治重點實驗室，天津300071

以淡水底棲動物花翅羽搖蚊(Chironomus kiiensis)幼蟲為受試生物，研究了沉積物中六氯苯(HCB)對其28 d的慢性毒性效應(yīng)，觀察搖蚊幼蟲的存活情況和活動行為，以死亡率、羽化率和羽化時間為受試終點，計算28 d試驗后沉積物中HCB對搖蚊的半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50, LC50)以及50%羽化時間(50% emergence time, EmT50)。結(jié)果表明，HCB對搖蚊28 d的LC50為59.8 mg·kg-1，對搖蚊羽化率的半數(shù)效應(yīng)濃度(half maximal effective concentration, EC50)為59.8 mg·kg-1。與大多數(shù)污染物不同，HCB有促進搖蚊幼蟲筑巢行為和羽化的作用，隨著HCB染毒濃度升高，搖蚊幼蟲筑巢行為加強，EmT50縮短。暴露于高濃度HCB(>21.6 mg·kg-1)時，搖蚊的EmT50與對照相比明顯縮短，尤其對雄性搖蚊影響更大。但與對照相比，HCB對羽化搖蚊的性別比沒有很大影響。

六氯苯；花翅羽搖蚊；沉積物；慢性毒性；羽化率；羽化時間；筑巢

六氯苯(hexachlorobenzene, HCB)是斯德哥爾摩公約首批控制的12種持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)之一[1-2]。HCB是一種選擇性的有機氯抗真菌劑，易導(dǎo)致生物體內(nèi)分泌紊亂，生殖及免疫機能失調(diào)，神經(jīng)行為和發(fā)育紊亂等，屬于典型的內(nèi)分泌干擾物[3]。研究報道，人類由于意外或職業(yè)暴露長期接觸HCB時，會表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀甚至是傳染病癥狀，例如卟啉癥等[4]。因此，許多國家于25年前限制或禁止生產(chǎn)HCB和其他活性較高的有機氯農(nóng)藥的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物[4]。然而由于HCB具有持久性和難降解性，并且HCB仍可能會摻雜在農(nóng)藥中或在一些化學(xué)過程中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生，而被非故意排放到環(huán)境中[6-8]。因此，HCB仍廣泛分布在環(huán)境中。HCB具有較高的辛醇/水分配系數(shù)(logKow=5.2)，進入水體后極易吸附到沉積物中并長期存在，蓄積其中的HCB可能對棲息于沉積物中的生物產(chǎn)生不良影響。目前關(guān)于HCB毒性研究主要集中在高等動物以及嚙齒類動物等上[9-11]，對環(huán)境中底棲生物尤其是淡水底棲生物毒性效應(yīng)研究較少。研究沉積物中HCB對底棲生物的毒性效應(yīng)，對于推導(dǎo)其沉積物質(zhì)量基準(zhǔn)和進行沉積物生態(tài)風(fēng)險評價具有重要意義。本文主要目的是研究沉積物中HCB對淡水底棲動物花翅羽搖蚊的慢性毒性作用，為淡水沉積物質(zhì)量基準(zhǔn)制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

花翅羽搖蚊(Chironomus kiiensis)，屬于搖蚊科、雙翅目長角亞目(Diptera: Nematocera)。搖蚊科的幼蟲生物量約占底棲生物量的70%～80%[12-13]，是種類多、分布廣、生物量大的淡水底棲動物類群之一[14]。搖蚊不同種屬之間的生態(tài)要求和生活習(xí)性多種多樣，對環(huán)境因子的敏感性使得它們成為水環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)良指示生物[15-16]。搖蚊是一類變態(tài)昆蟲，整個生命周期經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹及成蟲4個階段。幼蟲階段在其生活史中時間最長，占據(jù)整個生命周期的90%。幼蟲在成蛹前經(jīng)歷3次蛻皮，共4個齡期，此階段主要在水體沉積物中完成，與沉積物直接接觸時間較長，所以搖蚊幼蟲是底棲動物的代表性生物之一，可以用于檢測沉積物及化學(xué)品的生物毒性，也是美國國家環(huán)境保護局(USEPA)和歐盟推薦的生物毒性測試物種。故本文選取搖蚊幼蟲(花翅羽搖蚊)為受試生物。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

1.1.1 沉積物

由于在天津自然保護區(qū)等地難以獲得大批量背景值較低的沉積物，因此本文采用背景值較低的表層土，自然風(fēng)干后剔除較大礫石、木屑等雜物，過40目篩，室溫下保存。所選用土壤理化性質(zhì)與沉積物接近，Pasteris等[17]也曾嘗試用表層土作為沉積物用于生物暴露試驗，泥水平衡后完全可以模擬沉積物環(huán)境。經(jīng)測定所用沉積物(S)的理化性質(zhì)如下：顏色為黃褐色，pH為7.86，陽離子交換量為38.47 cmol·kg-1，有機質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(foc)為1.9%，機械組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為粉砂64%、粘土24%、沙子12%。

1.1.2 化學(xué)試劑

HCB( ≥ 95%)購自北京化工廠，HCB標(biāo)準(zhǔn)品( ≥ 98%)購自百靈威科技有限公司，丙酮(分析純)、正己烷(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)均購自天津康科德科技有限公司。

1.2 沉積物中HCB含量測定

取8 g(濕重，3個平行樣)HCB染毒沉積物，冷凍干燥、研磨、過篩、稱量后，采用正己烷和丙酮混合溶劑(體積比1∶1)作為提取液，超聲萃取60 min。過0.45 μm有機相膜，轉(zhuǎn)移至1.5 mL進樣瓶中，進行儀器分析。

分析儀器采用Agilent 7890A型氣相色譜儀。載氣為高純氮氣(純度>99.999%)，流速為2.0 mL·min-1，μ-電子捕獲檢測器。分離用HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，升溫程序：柱初溫60 ℃，恒溫2 min后以20 ℃·min-1的速率程序升溫至260 ℃，恒溫2 min；進樣口和檢測器溫度分別為230 ℃和300 ℃，進樣量1 μL。儀器檢測限為20 ng·L-1，方法檢測限為4.0 μg·L-1。定量方法采用外標(biāo)法。目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率為97%～115%。

1.3 染毒試驗

1.3.1 染毒沉積物制備

根據(jù)其他學(xué)者對環(huán)境中HCB含量檢測分析[2]以及預(yù)試驗結(jié)果，將沉積物HCB染毒濃度設(shè)定為5.00、10.0、20.0、40.0、80.0、120 mg·kg-1(以干重計)。將0.02 g HCB溶于20 mL二氯甲烷溶液中，作為儲備液待用。取不同量儲備液分別加入到一份干凈的干沉積物中(總重量為100 g，每次取約1/10)，攪拌均勻，置于通風(fēng)櫥內(nèi)。待二氯甲烷完全揮發(fā)后(1～2 d)，取一份潔凈沉積物與之混合，攪拌均勻。重復(fù)此過程，直至所有的干凈沉積物都混合均勻，加100 mL曝氣水并攪拌均勻，形成不同濃度的HCB染毒沉積物(如表1)。靜置2周，使泥水平衡。同時設(shè)置完全空白(只有相同量的潔凈沉積物)和試劑空白(沉積物中只加相同量的二氯甲烷)對照組。將每個含不同HCB濃度的染毒沉積物均分為5份(每個平行樣中含約20 g干沉積物)并分別置于100 mL玻璃燒杯中。

沉積物中有機質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.9%(測定采用重鉻酸鉀-還原容量法)[18]。為了確定染毒沉積物中HCB的實際濃度，利用1.2節(jié)所述方法分析測定了沉積物中的HCB含量，具體測定值見表1。潔凈沉積物中HCB的背景值為36.3×10-3mg·kg-1，遠低于試驗染毒濃度。

1.3.2 搖蚊幼蟲毒性試驗 花翅羽搖蚊取自沈陽化工研究院安全評價中心，搖蚊幼蟲在實驗室馴養(yǎng)于干凈水體中。用微型曝氣泵連續(xù)曝氣，水體pH (7.5±0.3)，采用自然光照(16 h光照，8 h黑暗)，溫度(23±1) ℃。試驗選用二齡搖蚊幼蟲(卵孵化后10 d左右，體長約為0.5 cm)。 28 d毒性試驗根據(jù)OECD 218指導(dǎo)規(guī)則進行[19]，隨機取10條二齡搖蚊幼蟲于HCB染毒沉積物中進行毒性試驗。搖蚊幼蟲引入后曝氣暫停6 h，使搖蚊幼蟲能穩(wěn)定待在沉積物中。將搖蚊食物(100%增色之素)用去離子水稀釋成食物溶液(約10 mg·mL-1)，每周喂食2次(每次約1 mL)，每條搖蚊幼蟲平均每天喂食0.25 mg。試驗開始1周后將燒杯口用紗布罩住，每天定期觀察，記錄搖蚊活動行為、死亡和羽化情況。當(dāng)有羽化蚊子出現(xiàn)時，將蚊子移出并分辨其性別。試驗中保證溫度、pH值、上覆水硬度等參數(shù)以及喂食次數(shù)與馴養(yǎng)期間一致。28 d試驗結(jié)束后，沉積物過篩，記錄存活幼蟲數(shù)量，并計算其存活率、羽化率和50%羽化時間(EmT50)，概率回歸法計算HCB對搖蚊28 d試驗的半數(shù)致死濃度(LC50)和對羽化率的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussions)

對完全空白和試劑空白結(jié)果進行t-檢驗(p<0.05)，結(jié)果表明完全空白和試劑空白之間無顯著性差異，在以下分析中均用試劑空白為對照組。

2.1 HCB對搖蚊幼蟲死亡率和羽化率的影響

慢性試驗中搖蚊幼蟲存活率為發(fā)生羽化的搖蚊數(shù)量與試驗結(jié)束后沉積物中存活的幼蟲數(shù)量之和。28 d試驗結(jié)束后，在完全空白組、試劑空白組和HCB處理組的沉積物中均沒有發(fā)現(xiàn)存活的搖蚊幼蟲，說明存活的搖蚊幼蟲都羽化為蚊子，所以搖蚊存活率等于其羽化率。試劑空白搖蚊存活率為83.3%(±7.07%)，由圖1可以看出，隨著HCB濃度增高，搖蚊幼蟲的平均存活率和羽化率降低。根據(jù)搖蚊平均存活率和羽化率，計算HCB對搖蚊28 d試驗后的LC50值為59.8 mg·kg-1(95%置信區(qū)間為[27.6,83.5])，HCB對搖蚊羽化率的EC50為59.8 mg·kg-1(95%置信區(qū)間為[27.6, 83.5])。

試驗過程中觀察到，搖蚊幼蟲在蛹期即將羽化為蚊子時容易發(fā)生死亡，有的甚至羽化至一半時死亡。當(dāng)HCB濃度為46.4、72.7和121 mg·kg-1時，搖蚊幼蟲在蛹期即將羽化或正在羽化時的死亡率分別為16.7%、36.7%和40.0%(見圖2)。同時還發(fā)現(xiàn)，高濃度HCB染毒組(72.7和121 mg·kg-1)，與空白對照組以及低濃度HCB染毒組相比，羽化蚊子的身體和翅膀都較軟，飛行無力。試驗過程中存活的搖蚊都成功羽化為蚊子，但是高濃度HCB(72.7和121 mg·kg-1)對蛹期搖蚊致死作用較明顯。HCB屬于內(nèi)分泌干擾物，作者推測其可能會干擾蛹期搖蚊幼蟲的某種激素分泌，最終干擾其羽化。

表1 沉積物試驗染毒濃度和實際測定濃度Table 1 The nominal and actual concentrations of the studied sediments

注：實際測定濃度值為3個平行的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

Note：The actual concentration is the mean value ± standard deviation of 3 parallels

表2 沉積物中HCB對搖蚊存活率、羽化率及50%羽化時間(EmT50)的影響Table 2 Effect of HCB in sediments on survival rate, emergence rate and (EmT50) of C. kiiensis

注：每個濃度組5個平行，表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，*p<0.05，**p<0.01。

Note: Every group has 5 parallels and values in the table are mean value ± standard deviation, *p<0.05，**p<0.01.

圖1 沉積物中六氯苯(HCB)對搖蚊存活率和羽化率的影響注：0 mg·kg-1組為試劑空白，*p<0.05，**p<0.01。Fig. 1 Influence of hexachlorobenzene (HCB) in sediments on survival and emergence rate of Chironomus kiiensisNote: 0 mg·kg-1 group is solvent control; *p<0.05, **p<0.01.

圖2 沉積物中HCB對蛹期搖蚊死亡率影響注：▲無蛹死亡，**p<0.01。Fig. 2 Effect of HCB in sediments on mortality of C. kiiensis pupaNote: ▲no pupa mortality, **p<0.01.

2.2 HCB對搖蚊活動行為的影響

大多數(shù)搖蚊都有建巢的習(xí)性，幼蟲筑巢營定居生活。巢是利用唾液腺分泌物(多為絲狀物)將前原足收集來的植物碎片、微細的淤泥或砂粒粘合起來而建成的。巢多筑在沉積物表面或埋于淤泥中。搖蚊幼蟲在巢中生活，筑巢的幼蟲從巢中伸出頭來攝取食物，隨著搖蚊幼蟲體長增長，所筑的巢也會增長。

比較不同處理組中搖蚊幼蟲在沉積物表面的筑巢數(shù)量發(fā)現(xiàn)，沉積物中HCB染毒濃度為21.6、46.4和72.7 mg·kg-1時，搖蚊幼蟲筑巢行為較試劑空白(圖3K)明顯加快(見圖3)，說明HCB對搖蚊的筑巢行為有促進作用。目前研究中發(fā)現(xiàn)多數(shù)污染物對搖蚊幼蟲的筑巢行為有抑制作用，Macdonald等[20]發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺酸(PFOS)對搖蚊幼蟲(Chironomus tentans)筑巢行為有明顯的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲多聚集在沉積物表面。Taylor等[21]發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲(Chironomus riparius)暴露于林丹后，其筑巢行為明顯受到抑制。關(guān)于污染物對搖蚊幼蟲筑巢行為活動有促進作用的報道甚少，具體的機理還需進一步研究確認。

圖3 搖蚊幼蟲在沉積物表面筑巢行為變化情況注：A-21.6 mg·kg-1，B-46.4 mg·kg-1，C-72.7 mg·kg-1，K-試劑空白。Fig. 3 Changes of tube building behavior of C. kiiensis on the surface of sedimentsNote: A-21.6 mg·kg-1, B-46.4 mg·kg-1, C-72.7 mg·kg-1, K-solvent control.

2.3 HCB對搖蚊羽化時間的影響

羽化時間是搖蚊生命周期試驗中常用的指示終點[21-24]，通常羽化時間比生長終點要敏感[25]，這可能是由于羽化涉及3個齡期和復(fù)雜的羽化過程。本研究結(jié)果表明，沉積物中HCB有加速搖蚊羽化的作用。與對照相比，HCB染毒組的搖蚊幼蟲提前羽化為成蟲。搖蚊一般是雄性先羽化，雌性比雄性羽化時間要遲2～7 d[23,24,26]，本研究結(jié)果也符合雄性先熟的規(guī)律(見表2)。整體來看，HCB對雌性和雄性搖蚊的羽化具有相似的加速趨勢。試劑空白中雄性搖蚊幼蟲平均EmT50約為24.7 d，雌性約為27.0 d。沉積物中HCB濃度為21.6和46.4 mg·kg-1時，雄性搖蚊平均EmT50均為23.0 d，比對照組顯著縮短(p<0.05)；當(dāng)HCB濃度升高至72.7和121 mg·kg-1時，雄性搖蚊平均EmT50均為22.0 d，與對照相比差異極顯著(p<0.01)。當(dāng)HCB染毒濃度為21.6、46.4和72.7 mg·kg-1時，雌性搖蚊平均EmT50約為25 d，與對照相比差異顯著(p<0.05)，HCB濃度高達121 mg·kg-1時，雌性搖蚊平均EmT50有所延長，約為25.8 d，但仍比對照短。雖然沉積物中HCB能顯著加速雄性和雌性搖蚊幼蟲的羽化，但是HCB對雄性搖蚊的影響更加明顯。HCB屬于內(nèi)分泌干擾物，可能在搖蚊幼蟲生長階段通過促進其前腦激活激素或前胸蛻皮激素的分泌來促進搖蚊的羽化，或者通過抑制搖蚊咽側(cè)體保幼激素的分泌來促進搖蚊的羽化，這與HCB能促進搖蚊幼蟲筑巢行為的結(jié)果是一致的。已有的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)污染物會抑制搖蚊幼蟲羽化，使其羽化時間推遲，例如重金屬(Pb、Cd、Cu等)、三丁基錫、多環(huán)芳烴(PAHs)、農(nóng)藥(林丹、毒死蜱和塞米寧等)等都導(dǎo)致?lián)u蚊幼蟲羽化時間延遲[21,24,27-28]。也有研究報道一些內(nèi)分泌干擾物，如2,4,5-三氯苯酚能加速搖蚊羽化，使羽化時間縮短[24,28]，這些推遲和促進作用可能是通過干擾搖蚊蛻皮和羽化過程來影響羽化時間的。Lowell等[30]發(fā)現(xiàn)紙漿廢水可以促進蒼蠅生長并影響蒼蠅的翅膀發(fā)育，該作者推測可能是紙漿廢水中的污染物刺激蒼蠅體內(nèi)激素或其他生長因素等原因造成的。Watts等[28]也發(fā)現(xiàn)17α-雌二醇會促進搖蚊幼蟲一代和二代的羽化時間，但沒有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

在染毒沉積物中搖蚊雄性和雌性性別比接近1∶1，與對照相比未發(fā)現(xiàn)有顯著差異(p>0.05)，說明HCB對搖蚊幼蟲的影響不存在性別差異。這與其他有機污染物對羽化搖蚊性別比的研究結(jié)果有所不同，如Lee等[31]曾研究八氯苯乙烯對搖蚊幼蟲(Chironomus tentans)生長、發(fā)育和繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)八氯苯乙烯使羽化搖蚊雄性數(shù)量明顯減少。Watts等[29]發(fā)現(xiàn)17α-乙炔雌二醇對搖蚊幼蟲的性別比有嚴(yán)重影響。導(dǎo)致這種差異的原因尚不清楚，需要更深入的研究。

綜上，HCB對搖蚊的致死效應(yīng)隨著濃度的升高呈現(xiàn)增高的趨勢，高濃度HCB對蛹期搖蚊致死作用明顯。HCB對搖蚊28 d試驗的LC50為59.8 mg·kg-1，對搖蚊羽化率的EC50為59.8 mg·kg-1。HCB對搖蚊幼蟲筑巢行為和羽化有明顯的促進作用，但對羽化搖蚊的性別比影響不大。

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ChronicEffectsofHexachlorobenzen(HCB)inSedimentstoChironomuskiiensisLarvae

Liu Li, Zhong Wenjue, Zhu Lingyan*

Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria of Ministry of Education/Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China

20 August 2013accepted20 September 2013

The chronic toxicities of hexachlorobenzen (HCB) in sediments to freshwater benthic organism Chironomus kiiensis were studied by exposing the larvae in HCB-spiked sediments for 28 days. During the experiment, the behavior of larvae was carefully checked. The mortality, emergence rate and emergence time were used as endpoints. The LC50(lethal concentration 50) and EmT50(50% emergence time) in 28-d tests were estimated. The results indicated that the survival rate was equal with the emergence rate and the LC50and EC50(half maximal effective concentration) of emergence were both 59.8 mg·kg-1. Different from most of the organic pollutants, HCB could accelerate tube building of larvae in sediments and emergence of adults. The acceleration of tube building of larvae and the emergence of adults were more obvious as the concentration of HCB in sediments increased. When the concentration of HCB in sediments was higher than 21.6 mg·kg-1, the EmT50was significantly lower than the control, especially for the male. However, HCB showed no significant effect on the sex ratio of adults.

hexachlorobenzen; Chironomus kiiensis; sediment; chronic toxicity; emergence rate; emergence time; tube building

國家水體污染控制與治理科技重大專項子課題(2012ZX07501-003)

劉麗(1987-)，女，碩士，研究方向為生態(tài)修復(fù)，E-mail: liliu829@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: zhuly@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130820001

劉麗，鐘文玨，祝凌燕，等. 沉積物中六氯苯對搖蚊幼蟲慢性毒性效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2014, 9(2): 261-267

Liu L, Zhong W J, Zhu L Y, et al. Chronic effects of hexachlorobenzen (HCB) in sediments to Chironomus kiiensis [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 261-267 (in Chinese)

2013-08-20錄用日期2013-09-30

1673-5897(2014)2-261-07

X171.5

A

祝凌燕(1969—)，女，博士后，特聘教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為有持久性有機污染物的環(huán)境過程及生物有效性、新型高效修復(fù)材料制備及水體污染控制效應(yīng)機理、水體沉積物環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)等，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文80余篇，其中SCI論文47篇。