李雅芬，王 寧，柏建雯

東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 長春 130024

金礦區(qū)中國林蛙體內(nèi)DNA甲基化水平

李雅芬，王 寧*，柏建雯

東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 長春 130024

采集金礦附近山區(qū)河流水質(zhì)、沉積物和當(dāng)?shù)貎蓷悇游镏袊滞軜悠?，?yīng)用高效液相色譜儀測定污染區(qū)和對照區(qū)林蛙體內(nèi)各組織器官的胞嘧啶(c)和5-甲基胞嘧啶(5-mc)含量，探討因金礦開采引起的汞污染以及對林蛙體內(nèi)組織器官DNA甲基化水平的變化，研究汞脅迫下，兩棲類動物體內(nèi)分子水平的影響。結(jié)果表明：金礦開采區(qū)河流水質(zhì)和沉積物已受到甲基汞污染，污染區(qū)林蛙體內(nèi)甲基汞含量遠(yuǎn)高于對照區(qū)；林蛙體內(nèi)各組織器官中DNA甲基化水平發(fā)生不同的變化：污染區(qū)林蛙肝臟和皮膚中DNA甲基化水平高于對照區(qū)，肌肉和腦干DNA甲基化水平低于對照區(qū)；雄性林蛙肝臟和腦干DNA甲基化水平高于雌性，肌肉和皮膚DNA甲基化水平卻低于雌性。以上結(jié)果說明汞脅迫下，中國林蛙體內(nèi)組織器官DNA甲基化水平可以發(fā)生一定的變化，環(huán)境中重金屬汞離子進(jìn)入林蛙體內(nèi)含量的不同，可以促進(jìn)或抑制其體內(nèi)甲基化水平的變化，引起基因毒性作用。

甲基汞；DNA胞嘧啶甲基化；中國林蛙；組織器官

汞和甲基汞對生物尤其是哺乳動物的毒害作用早已被世界衛(wèi)生機構(gòu)和科研者所公認(rèn)，可造成動物體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官的病變以及免疫毒性、生殖毒性和胚胎、發(fā)育毒性等，這些均與哺乳動物DNA甲基化水平的變化有關(guān)。DNA甲基化是一種重要的遺傳修飾，其作用機制是在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, MTase)的催化作用下，將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子中的甲基化基團添加到DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)[1]。DNA甲基化是動植物正常發(fā)育、分化所必需的，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育過程中具有重要的生物學(xué)意義[2]。研究表明，不同環(huán)境下DNA甲基化和染色體結(jié)構(gòu)的不同將引起基因表達(dá)產(chǎn)生差異，而影響哺乳動物DNA甲基化水平的因素很多，包括溫度、營養(yǎng)水平、重金屬脅迫和輻射等[3-4]。目前有關(guān)重金屬影響生物體內(nèi)DNA甲基化水平發(fā)生變化的研究主要集中在植物和農(nóng)作物方面，對動物的影響研究主要為哺乳動物和水生生物。如Lee Y W，Broday L，Costr M的研究表明，重金屬鎳處理中國倉鼠雖然在短期內(nèi)使細(xì)胞中甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)移酶的活性有所降低，但5-甲基胞嘧啶含量卻迅速升高[5]；Hix S，Augusto O認(rèn)為，叔丁基氫過氧化鐵能引起小牛胸腺DNA的甲基化水平提高[6]；Donald Yee 等研究了美國三藩市海灣中水生生物DNA甲基化水平，證明當(dāng)?shù)亟鸬V開采已經(jīng)導(dǎo)致大量的汞進(jìn)入環(huán)境而造成了嚴(yán)重的污染[7]；Maria Maldonado 等人研究蚯蚓中DNA 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)砷和汞對其影響最大，同時證明了土壤遭到重金屬的破壞，污染較重[8]。國內(nèi)如朱國念等的研究表明，重金屬離子的暴露極大地提高了鯽魚肝臟DNA的總甲基化水平，金屬離子的毒性作用干擾了鯽魚細(xì)胞的正常生理周期和基因表達(dá)，是引發(fā)水生生物基因毒性作用的主要機制[9]；曹哲明通過比較來自太湖三山島自然水域(污染區(qū))和南泉養(yǎng)殖基地(非污染區(qū))背角無齒蚌樣品不同組織的甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染尤其是重金屬污染對背角無齒蚌的基因表達(dá)有一定的影響[10]。這些成果對于我們了解重金屬脅迫下動植物受污染的狀況很有幫助，但對于礦區(qū)重金屬污染影響下，兩棲類動物體內(nèi)DNA的損傷或影響卻鮮見報道?；趲啄陙韺质A皮溝金礦汞污染生態(tài)環(huán)境影響的研究，采樣分析了汞和甲基汞對中國林蛙(Rana Chensinensis)體內(nèi)各組織器官DNA胞嘧啶水平和影響的程度，為充分揭示重金屬的遺傳毒性、深入探討金礦開采對當(dāng)?shù)貎蓷悇游锏亩竞C理提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況及樣品實驗(The general situation of research area and sample experiment)

1.1 研究區(qū)概況

夾皮溝金礦位于吉林省樺甸市東部，地理坐標(biāo)127°15′～127°30′E，42°41′～43°00′N；是一個典型的山區(qū)，地勢東南高、西北低，境內(nèi)由北向南分布有老牛溝河、夾皮溝河和山麻河，均從東向西匯入葦沙河，再經(jīng)紅石進(jìn)入第二松花江。夾皮溝地區(qū)為一個北西-南東向深大斷裂帶，分布有夾皮溝、老牛溝、老金廠、二道甸子等12個大小金礦，自1820年有組織有規(guī)模開采以來，至2006年一直使用混汞法進(jìn)行選礦。雖然我國自2000年以后已經(jīng)全面停止使用該法煉金，但此工藝開采金礦已帶來了諸如當(dāng)?shù)睾恿魉|(zhì)、土壤等嚴(yán)重污染的環(huán)境問題[11]。

1.2 樣品的采集與測定

1.2.1 樣品采集

中國林蛙實驗樣品來自夾皮溝金礦開采區(qū)內(nèi)老牛溝河、夾皮溝河和山麻河附近的林蛙飼養(yǎng)場，見圖1。對照樣品選擇與研究區(qū)氣候、地理等條件相似的吉林省輝南縣國家龍灣(中心點地理坐標(biāo)126°24E，42°20N)自然保護(hù)區(qū)林蛙飼養(yǎng)場。2011年5月和2012年5月在研究區(qū)老牛溝河上的五道溝、山麻河上的二道溝和馬家店以及輝南龍灣每一地點采集2～3齡林蛙5只，同時采集附近河流水和表層沉積物(0～10 cm)樣品，樣品采集情況見表1。水樣保存按照GB7468-87中的方法處理；沉積物自然風(fēng)干，去除雜質(zhì)，在陶瓷研缽中研磨，過80目篩待實驗；林蛙樣品經(jīng)處死、取各組織器官后保存。

圖1 金礦分布情況及采樣點分布圖Fig. 1 The gold distribution and distribution of sampling points

表1 樣品采集情況Table 1 Detail of the samplings

1.2.2 樣品測定

(1)樣品預(yù)處理

河流中水的樣品用巰基棉富集，鹽酸洗脫，用苯萃??；沉積物樣品取2.0 g樣品加入2 mL 2 mol·L-1的鹽酸攪拌，再加入1 mL 0.01 g·L-1的CuSO4溶液，浸提10 min。經(jīng)巰基棉富集，鹽酸洗脫、萃取后待測；林蛙樣品甲基汞含量測定：取2.0 g，先加2.0 g NaCl研磨，加2 mL 2 mol·L-1鹽酸進(jìn)一步研磨至糊狀。轉(zhuǎn)移至25 ml具塞比色管中，振搖10 min，靜置1 h；濾紙過濾；用苯萃取、離心，苯萃取后待測。

林蛙組織器官DNA甲基汞測定：每一采樣點分別取大小近似的雄蛙和雌蛙各5只，回實驗室處死后立即取其腦、肝臟、肌肉和皮膚，放入無水乙醇進(jìn)行脫水，存儲于2 mL高溫滅菌后的生物學(xué)離心管中，并于-20℃保存。用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的“UNIQ-10柱式動物基因組抽提試劑盒”提取林蛙各組織的DNA基因組，采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA基因組的提取程度。

(2)分析方法

水和沉積物、林蛙樣品按照氣相色譜法(GB17132-1997)測定其甲基汞含量。所有樣品均做3個平行，然后取平均。標(biāo)準(zhǔn)差±0.02，p<0.02，r=0.89。

圖2 提取中國林蛙DNA示意圖Fig. 2 The Extraction process of Rana Chensinensis

林蛙樣品提取之后的DNA基因組采用高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行測定，由積分面積5-mC/(5-mC+C)的百分?jǐn)?shù)檢測基因組DNA中5-mC的含量，即DNA甲基化的水平。高效液相色譜儀色譜柱條件為安捷倫1200系列的TC-C18(250 mm×4.6 mm)，10℃柱溫條件下，以10%甲醇、5 mmol·L-1的戊烷磺酸鈉、0.2%三乙胺混和液為流動相，流速為1.0 mL·min-1，紫外波長273 nm，靈敏度0.01 AUFS。每一樣品測3個平行樣取平均。選用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司胞嘧啶(c)和5-甲基胞嘧啶(5-mc)作為實驗的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL為進(jìn)樣量，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。胞嘧啶的線性關(guān)系為：y=2779.1x+75.049，5-甲基胞嘧啶的線性關(guān)系為: y=1899.1x+18.118。

2 結(jié)果及分析(Results and analysis)

2.1 環(huán)境介質(zhì)中甲基汞含量

氣相色譜法測定河流水體和沉積物樣品中的甲基汞含量，詳見表2，表中當(dāng)?shù)乇尘爸颠x自劉永懋編寫的《中國松花江甲基汞污染防治與標(biāo)準(zhǔn)研究》。

表2 河流水體與沉積物甲基汞含量Table 2 The average content of methylmercury in river water and sediment

上表可見，老牛溝河、山麻河水中甲基汞含量都比較高，單因子評價法評價水體中甲基汞污染程度為中度污染；沉積物中甲基汞含量遠(yuǎn)超過當(dāng)?shù)丨h(huán)境背景值，地累積指數(shù)評價為極高環(huán)境風(fēng)險。

2.2 林蛙體內(nèi)不同部位甲基汞含量

中國林蛙對甲基汞有較強的富集作用。其中腦中甲基汞平均濃度為52.6820 ng·g-1；肝中甲基汞平均濃度為52.6127 ng·g-1；肌肉中甲基汞濃度平均濃度為57.0850 ng·g-1；皮膚中甲基汞平均濃度為62.7674 ng·g-1；卵中甲基汞平均濃度為20.7216 ng·g-1。利用SPSS進(jìn)行了數(shù)據(jù)的顯著性檢驗，均為95%置信區(qū)間內(nèi)(p<0.05)。如表3和圖3。

表3 不同采樣點中國林蛙體內(nèi)不同部位甲基汞平均濃度(ng·g-1)Table 3 The methylmercury content of different parts of different sampling points(ng·g-1)

注：腦、肝為1個樣本；內(nèi)臟、肌肉為3個平行樣本；皮膚、卵為4個平行樣本；“-”為無樣本。

Note：Liver, brain is a sample; organs, muscles of three parallel samples; skin and eggs for 4 parallel samples; "-" for free samples.

圖3 不同采樣點中國林蛙體內(nèi)不同部位甲基汞濃度Fig. 3 Methylmercury content of different parts of different sampling points

表3可見，樺甸地區(qū)(污染區(qū))林蛙體內(nèi)甲基汞含量均高于對照點。從采用地點分析，林蛙腦干、肌肉、皮膚和雌蛙肝臟中甲基汞含量的分布均為：五道溝>馬家店>二道溝>輝南；雄蛙肝臟為五道溝>馬家店>輝南>二道溝；卵：五道溝>馬家店>輝南。林蛙各組織器官中甲基汞含量的分布并無規(guī)律，總體來看，皮膚較高，肝臟次之，卵最低。

結(jié)合表2河流水體和沉積物中甲基汞的測定數(shù)據(jù)可認(rèn)為，金礦開采對該地區(qū)已造成較嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致當(dāng)?shù)亓滞荏w內(nèi)甲基汞的積累加重。中國林蛙是一種兩棲動物，生活習(xí)性為每年4-9月在林間活動，9月到次年4月進(jìn)入河流水棲。冬季來臨時，林蛙群集于河床兩側(cè)深水處的砂礫或石塊下冬眠。水體和沉積物中的污染物可通過皮膚滲透進(jìn)入林蛙體內(nèi)。因此，中國林蛙體內(nèi)汞和甲基汞含量與水體、沉積物中汞和甲基汞含量有一定的相關(guān)性。通過計算不同采樣點林蛙體內(nèi)甲基汞含量對水和沉積物中甲基汞含量的富集因子，結(jié)果表明，甲基汞的富集因子幾乎都大于1.0，其中，林蛙/水體大于林蛙/沉積物。最大的富集因子為3.3696，最小的富集因子為0.8417。表明林蛙對水和沉積物中甲基汞存在一定的富集作用，但有一定限度。

2.3 林蛙體內(nèi)組織器官DNA胞嘧啶甲基化水平

2.3.1 林蛙組織器官中DNA胞嘧啶甲基化的平均水平

雖然中國林蛙體內(nèi)DNA甲基化水平存在著個體差異，但實驗證明棲息環(huán)境中汞污染的程度與其體內(nèi)甲基汞含量有著密切的聯(lián)系，對林蛙的脅迫作用可能導(dǎo)致其DNA胞嘧啶甲基化發(fā)生一定的變化。各采樣地點中國林蛙體內(nèi)肌肉中的DNA甲基化水平為0.0237～0.1449，肝臟中的DNA甲基化水平為0.0223～0.1994，皮膚中的DNA甲基化水平為0.0119～0.1027，腦中的DNA甲基化水平為0.0547～0.2308。見表4。

比較各采樣點林蛙體內(nèi)各部分DNA胞嘧啶甲基化的平均水平可見，輝南龍灣(對照區(qū))林蛙的腦和肌肉DNA甲基化水平較高，肝臟與皮膚較低；而金礦開采區(qū)(污染區(qū))的幾個采樣點中，二道溝林蛙肌肉和肝臟DNA甲基化水平較高，皮膚和腦較低；五道溝、馬家店采樣點林蛙體內(nèi)各部分DNA甲基化為肝臟和腦干比較高，皮膚和肌肉較低。

2.3.2 不同性別林蛙組織器官中DNA胞嘧啶甲基化水平

各采樣點不同性別林蛙組織器官的DNA胞嘧啶甲基化水平的比較見表5和圖4。

表4 不同采樣地點中國林蛙體內(nèi)各部分DNA甲基化水平數(shù)據(jù)Table 4 The different parts DNA methylation level of different sampling points (%)

表5 各采樣點不同性別林蛙體內(nèi)組織器官的DNA甲基化水平(均值)Table 5 DNA methylation levels of the organizations in Rana Chensinensis at every sampling points

圖4 林蛙體內(nèi)組織器官的DNA甲基化水平(%)Fig. 4 DNA methylation levels of the organizations in Rana Chensinensis(%)

對比林蛙體內(nèi)各組織器官DNA胞嘧啶甲基化水平可見，總體上林蛙肝臟和皮膚DNA甲基化水平仍與體內(nèi)甲基汞含量的分布相同即污染區(qū)高于對照區(qū)，肌肉和腦干中DNA甲基化水平呈現(xiàn)污染區(qū)低于對照區(qū)的現(xiàn)象。

分析了不同性別林蛙體內(nèi)組織器官DNA甲基化胞嘧啶水平的差別?？梢?，雄性林蛙肝臟和腦干中DNA甲基化水平高于雌性，肌肉和皮膚雄性低于雌性。

測定結(jié)果可見，中國林蛙受到汞和甲基汞脅迫后，體內(nèi)某些組織器官DNA甲基化程度會發(fā)生一定的變化，污染區(qū)林蛙肝臟和皮膚的DNA胞嘧啶甲基化水平比對照區(qū)林蛙高，而肌肉和腦干DNA甲基化水平下降。推測與林蛙長期暴露在汞污染的環(huán)境中有關(guān)。前人的工作證明，重金屬暴露能降低或提高哺乳動物肝細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs )的活性，使基因組DNA發(fā)生甲基化。周新文等人的實驗結(jié)果表明，肝臟細(xì)胞中的DNA總甲基化水平一般是較低的，如果暴露于含重金屬離子的水體中時，其甲基化水平就會大大提高[12]。其主要機制認(rèn)為，混合重金屬離子的暴露誘發(fā)了鯽魚組織的脂質(zhì)過氧化作用，繼而產(chǎn)生的自由基可以使DNA鏈發(fā)生斷裂，更加速了DNA甲基化水平的提高。Takiguchi 等[13]曾用鎘處理大鼠TRL1215肝臟細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)鎘暴露時間短時，降低了DNMTs活性，并基因組DNA 發(fā)生低甲基化，鎘暴露時間長時，則提高DNMTs活性發(fā)生基因組DNA的高甲基化。葛才林等[14]的實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬濃度較低時，可能會對相應(yīng)細(xì)胞DNA中胞嘧啶的甲基化起促進(jìn)作用，相反，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬濃度較高時，可能會對相應(yīng)細(xì)胞DNA中胞嘧啶的甲基化起抑制作用。朱國念等[6]通過實驗證明，多種重金屬離子混合條件下，鯽魚肝臟細(xì)胞的DNA總甲基化水平會由低迅速提高，干擾鯽魚細(xì)胞的正常生理周期和基因表達(dá)，引發(fā)水生生物的基因毒性作用。從本次實驗結(jié)果可見，重金屬汞的污染，可以使林蛙體內(nèi)不同組織器官DNA甲基化表現(xiàn)出不同的變化。也可以認(rèn)為，環(huán)境中重金屬汞離子進(jìn)入林蛙體內(nèi)含量的不同，可能會促進(jìn)或抑制其體內(nèi)甲基化水平的變化，從而引起林蛙的基因毒性作用。

除此之外，溫度[15]、營養(yǎng)供給[16 ]和輻射[17]等都能引起動物體內(nèi)DNA 甲基化水平的變化。Varriale 等[18]發(fā)現(xiàn)南極魚類甲基化程度高于熱帶魚類, 提示動物在進(jìn)化的過程中體溫與機體DNA 甲基化可能存在反比關(guān)系。因此，也說明夾皮溝地區(qū)存在使林蛙體內(nèi)DNA甲基化水平發(fā)生變化的條件。

總之，通過氣相色譜和液相色譜測定了夾皮溝金礦附近的河流水、沉積物、中國林蛙樣品中的甲基汞含量以及林蛙各組織器官中DNA甲基化水平。發(fā)現(xiàn)：(1)研究區(qū)內(nèi)老牛溝河和山麻河水體為甲基汞中度污染；沉積物為極高環(huán)境風(fēng)險；中國林蛙體內(nèi)不同部位的甲基汞濃度普遍高于對照點，說明了金礦開采對周圍地區(qū)生態(tài)環(huán)境造成了比較嚴(yán)重的汞污染；(2)中國林蛙體內(nèi)甲基汞含量分布為：皮膚>腦干和肝臟>卵；雌蛙和雄蛙無明顯差別；地區(qū)分布總體上表現(xiàn)為污染區(qū)高于對照區(qū)，五道溝>馬家店>二道溝>輝南；(3)污染區(qū)林蛙肝臟和皮膚的DNA胞嘧啶甲基化水平高于對照區(qū)，肌肉和腦干則低于對照區(qū)；不同性別林蛙組織器官DNA胞嘧啶甲基化水平為肝臟和腦干雄性高于雌性，肌肉和皮膚雄性低于雌性。證明金礦開采區(qū)河流水體、沉積物的汞污染對林蛙體內(nèi)組織器官DNA甲基化水平有一定影響，環(huán)境中重金屬汞離子進(jìn)入林蛙體內(nèi)含量的不同，可能會促進(jìn)或抑制其體內(nèi)甲基化水平的變化，引起基因毒性作用。

[1] Doerfler W. On the biological significance of DNA methylation [J]. Biochemistry (Moscow), 2005,70(5): 505-524

[2] Morris J. Genes, genetics, and epigenetics: A correspondence [J]. Science. 2001, 293(5532): 1103-1105

[3] Weidman J R, Dolinoy D C, Murphy S K, Jirtle RL. Cancer susceptibility: epigenetic manifestation of environmental exposures. Cancer J. 2007, 13(1): 9-16

[4] 曹家雪, 張紅平, 杜立新.環(huán)境因素對DNA 甲基化的影響[J]. 遺傳, 2013, 35(7): 839-846

Cao J X, Zhang H P, Du L X. Influence of environmental factors on DNA methylation[J]. Hereditas(Beijing). 2013, 35(7): 839-846 (in Chinese)

[5] Lee Y W, Broday L, Costr M. Effects of nickel on DNA methyltransferase activity and genomic DNA methylation levels [J]. Mutation research, 1998, 31: 213-218

[6] Hix S, Augusto O. DNA methylation by tert-butyl hydroperoxide-iron(2): A role for the transition metal ion in production of DNA baseadducts [J]. Chemico-Biological Interactions, 1999, 118(2): 141-149

[7] Yee D, McKee L J, Oram J J. A regional mass balance of methylmercury in San Francisco Bay, California, USA. Environmental Toxicology and Chemistry. 2011, 30(1): 88-96

[8] Santoyo M M, Flores C R, Torres A L, Wrobel K, Wrobel K. Global DNA methylation in earthworms: A candidate biomarker of epigenetic risks related to the presence of metals/metalloids in terrestrial environments [J]. Environmental pollution, 2011, 159(10): 2387-2892

[9] 朱國念,周新文,孫錦荷.混合重金屬離子誘導(dǎo)的鯽魚DNA損傷與基因表達(dá)[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2003, 17 (3): 199-202

Zhu G N, Zhou X W, Sun J H. DNA damage and its gene expression of fish induced by mixture-metals [J]. Acta Agriculturae Nucleatae Sinic, 2003, 17 (3):199-202 (in Chinese)

[10] 曹哲明, 楊 建. 背角無齒蚌不同組織的基因組DNA甲基化分析[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2009, 18(6): 2011-2016

Cao Z M, Yang J. Analysis of the methylation in genome DNA from different tussues of Anodonta woodiana [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2009, 18(6): 2011-2016 (in Chinese)

[11] 李雅芬, 王 景, 王 寧. 松花江上游金礦開采區(qū)河流水體和沉積物中汞的污染特征及風(fēng)險評估[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2013,32(3):622-628

Li Y F, Wang J, Wang N. Distribution characteristics and risk assessment of mercury pollution in the river water and sediment of the Songhua River upstream gold mining area [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013, 32(3): 622-628 (in Chinese)

[12] 周新文, 朱國念, 孫錦荷, 等. Cu、Zn、Pb、Cd及其混合重金屬離子對鯽魚DNA(Carassius aruatus)甲基化水平的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2001, 21(6): 549-552

Zhou X W, Zhu G N, Sun J H, et al. Influence of Cu, Zn, Pb, Cd and their heavy metaltion misture on the DNA methylation level of the fish (Carassius aruatus) [J]. China Environmental Science, 2001, 21(6): 549-552 (in Chinese)

[13] Takiguchi M, Achanzar W E, Qu W, Li GY, Waalkes MP. Effects of cadmium on DNA-(Cytosine-5) methy-ltransferase activity and DNA methylation status during cadmiuminduced cellular transformation [J]. Experimental Cell Research, 2003, 286(2): 355-365

[14] 葛才林, 楊小勇, 劉向農(nóng), 等.重金屬脅迫對作物DNA胞嘧啶甲基化的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù), 2002, 21(4): 301-305

Ge C L, Yang X Y, Liu X N, et al. Effect of heavy metal stress on levels of methylation in DNA of crop[J]. Agro-Environmental Protection, 2002, 21(4): 301-305

[15] Navarro-Martín L, Vi as J, Ribas L, et al. DNA methylation of the gonadal aromatase (cyp19a) promoter is involved in temperaturedependent sex ratio shifts in the European sea bass [J]. PLoS Genetics, 2011, 7(12): e1002447

[16] Lyko F, Foret S, Kucharski R, et al. The honey bee epigenomes: Differential methylation of brain DNA in queens and workers [J]. PLoS Biology, 2010, 8(11): e1000506

[17] Kovalchuk O, Burke P, Besplug J. Methylation changes in muscle and liver tissues of male and female mice exposed to acute and chronic low-dose X-ray-irradiation [J]. Mutation Research, 2004, 548(1-2): 75-84

[18] Varriale A, Bernardi G. DNA methylation and body temperature in fishes [J]. Gene, 2006, 385: 111-121

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InVivoDNAMethylationLevelsofRanaChensinensisinGoldMiningArea

Li Yafen, Wang Ning*, Bai Jianwen

School of Environment, Northeast Normal University, Changchun 130024, China

16 May 2014accepted25 June 2014

The river water, sediment and Rana Cheninensis samples in a mountain area near a gold mine were collected and the control samples were collected from none-polluted area. The Hg contamination and its molecular influencing on different organs of Rana Cheninensis were studied. The amount of methyl mercury (Me-Hg) of these samples were tested with gas chromatography and the amount of cytosine (c) and 5-methylcytosine (5-mc) in organs of Rana Cheninensis were measured by using HPLC. The results showed that river water and sediment around gold mine were contaminated with Me-Hg. The amount of Me-Hg in Rana Cheninensis from the contaminated area was higher than that of the control area. Significant DNA methylation discrepancy was found in control and the experimental groups. The methylation levels of liver and skin tissues were higher in contaminated Rana Cheninensis, however, they were lower in muscle and brainstem. Interestingly, compared with the female ones, male Rana Cheninensis showed higher DNA methylation level in liver and brainstem but lower DNA methylation level in muscle and skin. These results showed that DNA methylation level in Rana Cheninensis organs could be altered under Hg suppressions. Different amount of methyl mercury in Rana Cheninensis could cause variation in DNA methylation level, and thus accumulated genotoxicity.

methylmercury; DNA cytosine methylation; Rana Chensinensis; organs

國家自然科學(xué)基金(40673059); 全國大學(xué)生創(chuàng)新性實驗

李雅芬(1987-), 女, 碩士研究生, 研究方向為環(huán)境毒理學(xué), E-mail: liyf990@nenu.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author): E-mail: nwang@nenu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140516002

2014-05-16錄用日期：2014-06-25

1673-5897(2014)5-956-08

： X171.5

： A

王寧(1952—)，女，博士，教授，主要研究方向為元素地表過程及環(huán)境效應(yīng)。

李雅芬, 王 寧, 柏建雯, 等. 金礦區(qū)中國林蛙體內(nèi)DNA甲基化水平[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2014, 9(5): 956-963

Li Y F, Wang N, Bai J W, et al. The study of in vivo DNA methylation levels of Rana Chensinensis in Gold Mining area [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(5): 956-963 (in Chinese)