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(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

梅州金柚果肉中過氧化物酶特性的研究

黎婕,陳中*,林偉鋒

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

以愈創(chuàng)木酚為底物,對金柚果肉過氧化物酶(POD)的特性進行研究。結(jié)果表明,POD的最適提取pH為6.4,最適反應(yīng)溫度范圍為30～80℃,在范圍為5.0～8.0的pH環(huán)境下POD的活性變化不大,選擇6.8作為其最適反應(yīng)pH。在本實驗條件(pH6.8,30℃)下,Vmax=25.64U/min,Km=8.74mmol/L,高于80℃處理,POD開始被鈍化。

梅州金柚,過氧化物酶,酶學(xué)特性

柚類是柑橘家族中和的后起之秀,它果形碩大、果肉晶瑩、風(fēng)味獨特,其維生素C的含量比甜橙、橘類高2～4倍、耐貯藏運輸,號稱天然罐頭[1]。柚子成熟后富含糖類抗壞血酸和一些酶類,整體存放的柚子可以維持較長時間。但是在加工過程和存放過程中,顏色會逐漸變深,嚴重影響感觀質(zhì)量和產(chǎn)品的商品價值。褐變是柚子加工過程中最容易發(fā)生的現(xiàn)象,褐變一般有兩種：一種是非酶褐變；另一種是酶促褐變,柚子中的單寧等物質(zhì)在多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)和過氧化物酶(Peroxidase,POD)作用下生成褐色產(chǎn)物[2]。作者已對梅州金柚中多酚氧化酶的特性進行過系統(tǒng)研究[3],故本實驗以梅州金柚中的過氧化物酶作為研究對象。果蔬中的POD通常與新鮮產(chǎn)品或加工產(chǎn)品(包括冷凍產(chǎn)品)的風(fēng)味和品質(zhì)有關(guān),食品加工研究人員已將其活性列為果蔬加工的主要指標[4]。目前,關(guān)于植物體內(nèi)過氧化物酶的研究多數(shù)集中于它的理化過程,對金柚過氧化物酶的酶學(xué)特性研究報道很少。金柚果實脆嫩化渣、味甜少酸、營養(yǎng)豐富,深受消費者歡迎[5]。梅州金柚已有百年栽培歷史。目前,梅州市金柚種植總面積40萬畝,年產(chǎn)量在50萬噸以上,是全世界最大的金柚商品生產(chǎn)基地,是享譽盛名的“中國金柚之鄉(xiāng)”[6]。本實驗較為系統(tǒng)地對梅州金柚果肉中過氧化物酶的酶學(xué)特性進行研究,為進一步利用這一優(yōu)良資源,科學(xué)控制深加工過程中的酶促褐變提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

梅州金柚 市售；丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、巴比妥鈉、鹽酸、愈創(chuàng)木酚、30%過氧化氫 分析純。

JM-L50膠體磨 溫州市龍灣永興張祥膠體磨廠；JJ-2B 高速組織搗碎機 常州市偉嘉儀器制造有限公司；UV6100A紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；5418小型高速離心機 德國eppendorf有限公司；TC10K電子天平 美國雙杰兄弟(集團)有限公司；B11-2轉(zhuǎn)速數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.2粗酶液的制備

[7]，將柚子去皮、去囊,將一定量柚子肉在膠體磨中打成漿狀,量取100mL肉漿,加入200mL丙酮(-20℃),高速組織搗碎機以8000r/min勻漿2min,用布氏漏斗抽濾,濾餅用200mL丙酮(-20℃)再次抽濾,將濾餅置于蒸發(fā)皿中,用冷風(fēng)將殘留的丙酮吹干,約得白色粉末12g,即為過氧化物酶丙酮抽提粉,以下簡稱為丙酮粉,將丙酮粉置于-20℃下存放。取丙酮粉1.0g,加入100mL預(yù)冷(4℃)磷酸緩沖溶液(0.05mol/L,pH6.4),磁力攪拌30min,5000r/min離心20min,上清液過濾即得POD粗酶液。

1.3 POD酶活力的測定

參比液為磷酸緩沖溶液2.25mL(0.05mol/L,pH6.4)、2%愈創(chuàng)木酚溶液0.75mL、2%過氧化氫溶液0.75mL,搖勻后在水浴中預(yù)熱10min；待測液為磷酸緩沖溶液1.5mL(0.05mol/L,pH6.4)、愈創(chuàng)木酚溶液0.75mL、2%過氧化氫溶液0.75mL,搖勻在水浴中預(yù)熱10min,測定前再加入預(yù)熱的POD粗酶液0.75mL,馬上在470nm波長下進行比色測定,酶液加入后開始計時,每1s記錄一次吸光值OD值,共記錄5min,對照不加酶液的參比液,酶活力以1minOD值每增0.01為一個活力單位。

1.4 POD最適提取pH的測定

在制備POD粗酶液時,將丙酮粉置于pH分別為5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4磷酸緩沖溶液(0.05mol/L)中,制備成不同pH的POD粗酶液,測定時選用pH6.4的磷酸緩沖溶液(0.05mol/L)、2%愈創(chuàng)木酚溶液,在30℃下按照1.3中的方法測定不同pH粗酶液的POD酶活力的變化。以最高酶活力為100%,計算POD相對酶活。

1.5 POD最適反應(yīng)pH的測定

配制pH為3、4、5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、8、9、9.6的一系列緩沖溶液,測定時選用pH6.8提取的POD粗酶液、2%愈創(chuàng)木酚溶液,在30℃下按照1.3中的方法測定不同pH緩沖溶液的POD酶活力的變化。按照1.3中方法測定不同pH下POD活性的變化。以最高酶活力為100%,計算POD相對酶活。

1.6 POD最適反應(yīng)溫度的測定

取pH6.4磷酸緩沖溶液(0.05mol/L),20mL 2%愈創(chuàng)木酚溶液10mL、2%過氧化氫溶液10mL和pH6.8下提取的POD粗酶液5mL分別在30、40、50、60、70、80、90℃的水浴中保溫10min,按照1.3中的方法測定不同溫度下POD活性的變化。以最高酶活力為100%,計算POD相對酶活。

1.7底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系以及POD米氏常數(shù)Km值的測定

分別配制濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的愈創(chuàng)木酚溶液,測定時選用pH6.8提取的POD粗酶液,在pH6.4緩沖溶液體系、30℃下按照1.3中的方法進行測定,比較不同底物濃度下POD的活性變化。并求出相應(yīng)的反應(yīng)速率(以△A/min來表示),根據(jù)Lineweaver和Burk提出的雙倒數(shù)法作圖求出Km和Vmax值。

1.8 POD的熱穩(wěn)定性研究

取pH6.4磷酸緩沖溶液(0.05mol/L)20mL,2%愈創(chuàng)木酚溶液10mL、2%過氧化氫溶液10mL和pH6.8下提取的POD粗酶液5mL分別在30、40、50、60、70、80、90、100℃的水浴中保溫30min,馬上冷卻至室溫,再分別在30℃下保溫10min,按照1.3中的方法測定不同溫度下POD活性的穩(wěn)定性。以最高酶活力為100%,計算POD的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD最適提取pH的測定

圖1所示為不同pH緩沖溶液提取的POD粗酶液測定的活性變化。由圖1可知,在pH6.0～6.6之間,POD的相對酶活都保持在80%以上,在pH5.8和高于pH7.0時,POD的相對酶活下降到只有最高處pH6.4時的60%左右,因此,在以下實驗中均使用pH6.4的磷酸緩沖溶液制備粗酶液。圖1所示的相對酶活變化趨勢表明,提取pH的升高或降低會引起酶活性的下降,在pH6.0以下酶活變化比較明顯。這可能與酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)[4],酸性條件下,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化造成酶活減弱,而在堿性條件下酶的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、活性處于休眠狀態(tài)。不同來源的POD,其粗酶液的提取pH也不相同,例如荔枝果皮為pH6.6[8],板栗為pH5.5[9],大豆為pH6.0[10]等,POD的最適提取pH可能與POD的種類有關(guān)。

圖1 POD的最適提取pH

2.2 POD最適反應(yīng)pH的測定

為了準確地找出金柚果肉POD的最適反應(yīng)pH范圍,實驗首先在較廣泛pH(3.0～9.6)范圍內(nèi)進行,然后在酶活較高的pH(5.8～8.0)范圍內(nèi)再細分測定,圖2中只表示出有代表性的點。測定的pH體系為：pH3.0～5.0,磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0.2mol/L)；pH5.8～8.0,磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.05mol/L)；pH9.0～9.6,巴比妥鈉(0.04mol/L)-鹽酸(0.2mol/L)緩沖液。金柚果肉POD活性對環(huán)境pH敏感度與PPO比較,金柚果肉PPO酶活性對環(huán)境酸堿度非常敏感,當(dāng)pH在6.0～6.6范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高活性；當(dāng)pH小于6.0或者大于6.6時,PPO酶活性開始下降；當(dāng)pH小于5.0或者大于7.0時,活性迅速下降[3]；由圖2可知,POD受環(huán)境pH的影響沒那么大,在較大范圍pH5.0～8.0之間,POD的相對酶活都能保持在60%以上,且在pH6.8的體系下,所測POD活性最大；當(dāng)pH小于5.0或者大于8.0時,活性迅速下降；在pH為3.0和9.6時,POD活性分別有最大時的14.8%和36.1%。由此推斷在金柚加工過程中,通過控制pH較難起到抑制酶活性的作用,因此要對金柚果肉POD的性質(zhì)進行進一步研究,才能找到減輕其褐變的方法。

不同來源POD的最適反應(yīng)pH不一樣,但比較接近。如以愈創(chuàng)木酚為底物時,草莓[11]、葡萄[12]、和番茄[13]等果實的POD的最適pH分別為6.0、5.5和5.5。Civello等發(fā)現(xiàn)草莓POD在pH4.0～11.0比較穩(wěn)定,低于pH3.0時POD基本失活[9]；而辣椒POD在pH6.0～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,在pH5.0以下是失活很快,而pH3.0時完全失活[14]；也有文獻報道,荔枝果皮POD在pH4.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,在pH3.0以下完全失活[15]。

POD最適反應(yīng)pH隨酶的來源(不同果蔬產(chǎn)品)、同功酶的組成、氫供體底物及緩沖溶液等的不同而有差異。有些果蔬中POD的最適反應(yīng)pH范圍較寬,原因是存在不同最適反應(yīng)pH的同功酶；另外,同一果蔬產(chǎn)品POD的可溶性部分和化學(xué)結(jié)合部分的最適反應(yīng)pH可能也不同[3]。有報道分析[16],pH影響POD活性的原因如下：pH的改變會改變酶的活性中心相關(guān)基團的解離狀態(tài),從而影響酶的活性。植物所含過氧化物酶為含鐵過氧化物酶,以正鐵血紅素III作為輔基,在pH較低的酸性環(huán)境下,酶中的鐵離子能夠被解離出來,使酶失活；而在堿性條件下鐵離子會解離出來并生成Fe(OH)3,使酶活性顯著降低。大部分來源的POD在中性偏酸的介質(zhì)環(huán)境下,酶的活性最高。

圖2 POD的最適反應(yīng)pH

2.3 POD最適反應(yīng)溫度的測定

圖3為PPO粗酶液和底物分別在不同溫度下處理10min,再混合進行測定的效果圖。由圖3可知,金柚果肉POD的最適反應(yīng)溫度范圍較廣,溫度在30～80℃之間活性保持較高值；在溫度高于80℃時,隨著溫度的升高,酶活性明顯降低。與其最適pH相類似,POD的最適反應(yīng)溫度也與酶的原料種類、果蔬品種、同功酶的組成,緩沖液的pH、酶的純化程度等因素有關(guān)。以愈創(chuàng)木酚為底物,蓮藕POD的最適溫度為35℃[17],豆殼[18]和草莓果實[9]POD的最適反應(yīng)溫度分別為45℃和30℃。溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)的速率[19]。首先,升高溫度增加底物分子的熱能,增高反應(yīng)的速率。然而較高的溫度會帶來第二種效應(yīng),即導(dǎo)致酶的變性。升高溫度以提高反應(yīng)速率的總效應(yīng)是這兩個相反效應(yīng)之間的平衡。

圖3 POD的最適反應(yīng)溫度

2.4底物濃度和POD活性的關(guān)系

由圖4可以看出,底物在低濃度時(<4%),底物濃度和反應(yīng)速率有一定的正比關(guān)系,隨著底物濃度的增加,反應(yīng)速率也相應(yīng)地增加；當(dāng)?shù)孜镞_到一定濃度(≥4%),底物濃度再增加,反應(yīng)速率與濃度不再具有線性關(guān)系,吸光值的變化隨著濃度的增大反而降低。說明金柚果肉POD以愈創(chuàng)木酚為底物,其最適反應(yīng)濃度為4%,再增加底物濃度對酶的活性作用不大,這與Michaelis-Menten假說是相一致的,因此,可根據(jù)Lineweaver和Burk提出的雙倒數(shù)法作圖求出Km和Vmax值。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)求得v-1與s-1的線性回歸方程為v-1=0.341 s-1+0.039,相關(guān)系數(shù)R2=0.988。即以愈創(chuàng)木酚為底物,在本實驗的條件下(pH6.8,30℃),金柚果肉中POD的Vmax=25.64U/min,Km=8.74mmol/L(參見圖5)。

在H2O2存在的情況下,POD能催化多種物質(zhì)氧化并形成褐色物質(zhì)[20],包括酚類、芳香胺類、還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等[3]。愈創(chuàng)木酚被認為是POD的最適底物,葡萄[10]和大豆[21]POD對愈創(chuàng)木酚的Km分別為5.5、5.9mmol/L,豌豆[22]三種POD同功酶對愈創(chuàng)木酚的Km分別為10.2、10.8、10.2mmol/L,荔枝果皮[13]POD對愈創(chuàng)木酚的Km為2.75mmol/L,可見愈創(chuàng)木酚對不同來源的POD的親和力是不一樣的,同時證明了Km值的大小表示底物與酶的親和力的大小。

圖4 底物濃度與酶活的關(guān)系

圖5 米氏常數(shù)的測定

2.5 POD熱穩(wěn)定性研究

將粗酶液、底物和H2O2分別在30、40、50、60、70、80、90、100℃保溫30min后,再調(diào)至最適溫度30℃測定POD活性,得到結(jié)果如圖5。由圖5可知,在30～80℃范圍內(nèi),POD均能保持較高活性,與文獻報道[23]中過氧化物酶是耐熱性最強的酶之一的結(jié)論相符；當(dāng)溫度高于80℃處理后的酶液,活性開始迅速下降,90℃處理30min后,POD活力只有最大時的13.15%,100℃處理30min后,POD活力下降到最大時的4.7%。因此在實際生產(chǎn)中,應(yīng)采用長時熱燙處理,才能降低直至破壞果蔬組織中的POD活性,達到控制果蔬的酶促褐變的目的。

從酶分子本身來看,POD的熱失活包括以下過程：全酶分子輔基的解離；脫輔基酶蛋白構(gòu)象的變化；輔基的修飾或降解。不同POD同功酶的耐熱性存在差異,但這種差異在很大程度上取決于酶來源于何種果蔬[3]。例如荔枝果皮[13]POD表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性,在60℃以下穩(wěn)定,超過60℃酶活力開始下降,80℃處理30min尚保持39.8%的酶活力,與大豆[19]POD相似。草莓果實[9]POD在60℃僅5min就失活80%以上?？刂芇OD熱失活的主要指標是熱處理的時間和溫度,而在一定溫度下,熱處理時間足夠長時會使POD的失活更完全。但長時間加熱對保持果蔬的營養(yǎng)和風(fēng)味不利,因此對于類似本文中研究的金柚果肉中這類耐熱性強的POD,為達到抑制酶活的目的,除考慮加熱外,還需添加其他抑制劑。

圖6 POD的熱穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本文較為系統(tǒng)地研究了金柚果肉中過氧化物酶的動力學(xué)特征及相關(guān)特性。本實驗以愈創(chuàng)木酚為底物的結(jié)果表明：金柚果肉過氧化物酶的最適提取pH為6.0～6.6,其活性受環(huán)境pH影響較小,在pH5.0～8.0的范圍內(nèi)POD活性變化不大,選擇pH6.8作為其最適反應(yīng)pH,最適溫度選擇在30～80℃均影響不大,耐熱實驗結(jié)果表明,80℃以上處理30min POD活性才開始下降,其具有較強的耐熱性。金柚果肉過氧化物酶的動力學(xué)參數(shù)Km為8.74mmol/L,Vmax=25.64U/min。

經(jīng)與其他來源POD的特性比較,金柚果肉POD具有較寬的反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度,且具有較強的耐熱性,因此在實際加工過程采取的抑制其活性的手段,除常見的調(diào)節(jié)pH和加熱外,還需加入某些抑制POD活力的化合物,這部分會在以后實驗中繼續(xù)研究。

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Study on enzymatic characteristics of Peroxidase(POD)in pomelo

LIJie,CHENZhong*,LINWei-feng

(School of Light Industry and Food science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Using guaiacol as substrates,the characteristics of peroxidase(POD)extracted from pomelo was studied. The results showed that the optimum extracting pH of POD was 6.4,the optimum range of temperature and pH of POD catalytic reaction were 30～80℃ and 5.0～8.0,respectively. Kmwas 8.74mmol/L and Vmaxwas 25.64U/min. The POD was inactivated when the temperature was higher than 80℃.

pomelo;peroxidase;enzymatic characteristics

2013-06-13 *通訊聯(lián)系人

黎婕(1988-),女,碩士,研究方向：糧食油脂及植物蛋白工程。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0133-04