程 偉 左瑞雨 常 娟 尹清強* 王 平 黨曉偉

(1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，鄭州 450011;3.河南省畜牧局，鄭州 450008;4.河南德鄰生物制品有限公司，新鄉(xiāng) 453000)

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)2002年資料，世界上約有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染［1］，而危害飼料最嚴重的有黃曲霉(Aspergillus flavus)、鐮刀菌和青霉3種。黃曲霉毒素是由黃曲霉等多種真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物［2］，所產(chǎn)生的黃曲霉毒素包括 B1、B2、G1、G2、M1、M26 種類型，其中分布范圍最廣、化學性質(zhì)最穩(wěn)定、毒性最高的是黃曲霉毒素B1(AFB1)。AFB1在1993年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構劃定為甲類致癌物，嚴重時可導致肝癌甚至死亡［1，3］。動物在采食含有不同劑量黃曲霉毒素的飼糧時，表現(xiàn)為生長受阻、采食量減少、飼料利用率降低、被毛粗亂、精神沉郁、厭食、免疫抑制、肝損傷、黃疸、凝血病、貧血、出血性腹瀉等不同癥狀，嚴重時可導致動物死亡。另外，飼料霉變后營養(yǎng)物質(zhì)平均損失15%，甚至完全失去飼用價值［4］。霉菌毒素的脫毒方法一般有物理、化學和生物脫毒法。物理和化學方法因其操作困難、成本高、效果差，無法用此類方法對大批量的飼料進行處理，而且經(jīng)化學脫毒處理后往往會降低飼料的營養(yǎng)品質(zhì)和適口性，造成污染環(huán)境并存在安全隱患，故在實際生產(chǎn)中均不適用［5-6］。大量的研究證實，生物脫毒法是最有效的方法［7-8］。但生物脫毒法存在著優(yōu)良菌種少和霉菌毒素降解酶效價低等問題。體外解毒試驗表明，益生菌與霉菌毒素降解酶組合可有效地降解AFB1。本研究為了驗證該組合體內(nèi)試驗的有效性，有意地提高肉雞基礎飼糧中AFB1的含量，通過肉雞的飼養(yǎng)試驗，研究肉雞在采食高劑量AFB1飼糧時的反應及解毒效果，為最終消除霉菌毒素的危害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗用微生物的準備

乳酪桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、黃曲霉及產(chǎn)黃曲霉毒素降解酶的米曲霉由河南農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究室分離和保存。乳酪桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)后制成凍干菌粉，其有效活菌數(shù)分別為 1.58×1011、1.77×1010和1.28×109CFU/g。各種微生物的培養(yǎng)參照前人的報道［9-10］。

1.2 AFB1降解酶粗酶液的制備

挑取降解AFB1米曲霉菌株，將其涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基固體平皿上。PDA培養(yǎng)基的制備方法為:葡萄糖20.0 g，可溶性淀粉6.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO41.0 g，酵母2 g，大豆蛋白胨5 g，瓊脂粉15 g，用蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌后傾倒于固體平皿。平皿接種后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱至孢子大量產(chǎn)生時(約96 h)，在平皿中加入適量滅菌生理鹽水，用涂布棒將平皿上的孢子刮下，用4層紗布過濾以除去菌絲殘體，將孢子濃度調(diào)整為 1×108CFU/mL，按每瓶5 mL接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后收獲。按照固液比1∶2的比例將固體發(fā)酵培養(yǎng)物與生理鹽水混合均勻，室溫浸泡1 h(浸泡過程中間斷攪拌)。浸泡完成后先用8層紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)物，之后將濾液在12 000 r/min條件下離心5 min，再用定性濾紙過濾，最后用0.20 μm的濾膜過濾除菌后保存于4℃冰箱中，即為米曲霉所產(chǎn)降解 AFB1的粗酶液。

1.3 益生菌和AFB1降解酶的制備

乳酪桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌的干粉與降解AFB1的粗酶液按2∶3(m/v)的比例混合后，低溫烘干制備益生菌和AFB1降解酶即為霉菌毒素解毒劑，具體配比流程和原理參照前期本研究室的研究結果［10］。

1.4 含有AFB1的發(fā)霉玉米制備

挑取活化過的黃曲霉孢子，將其涂布于黃曲霉固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至孢子大量產(chǎn)生時收獲(約120 h)。在平皿中加入適量滅菌生理鹽水，用涂布棒將平皿上的孢子刮下，制成黃曲霉孢子懸液(孢子濃度約為1×108CFU/mL)。然后取粉碎后的玉米800 g(過8目篩)，裝入2 L三角瓶中，加水400 mL攪拌均勻后于121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min。冷卻后接種黃曲霉孢子懸液20 mL，用滅菌玻璃棒拌勻后置于28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。7 d后收獲，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min以殺滅霉菌孢子，置于65℃烘箱中烘干。將不同三角瓶中的發(fā)霉玉米混合均勻，粉碎過20目篩，避光保存。測定其中AFB1的含量為3 961.04 μg/kg。

1.5 試驗設計與飼養(yǎng)管理

采用單因子試驗設計，選擇1日齡健康的健康愛拔益加(AA)肉仔雞200只，隨機分為5個組，每個組5個重復，每個重復8只雞，公母各占1/2。A組(對照組)飼喂基礎飼糧(AFB1含量178.79 μg/kg)，B(負對照組)、C、D 和 E 組分別在基礎飼糧添加 100 μg/kg的 AFB1，并按照0、0.05%、0.10%和0.15%的比例分別添加益生菌和AFB1降解酶。飼養(yǎng)試驗在河南農(nóng)業(yè)大學畜牧站進行，采用多層籠養(yǎng)，每天分3次定時飼喂試驗飼糧，自由采食和飲水，24 h光照，自然通風，免疫程序按常規(guī)進行。試驗期21 d。

1.6 試驗飼糧

試驗飼糧參照NRC(1994)肉雞飼養(yǎng)標準配制。用不同比例的發(fā)霉玉米替代基礎飼糧中的正常玉米，飼糧為粉狀。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.7 測定指標及方法

1.7.1 生長性能測定

每天記錄各重復雞只的采食量，觀察記錄雞的健康狀況和腹瀉情況。在第1天和第21天進行空腹稱重，計算雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹瀉率。

腹瀉率=總腹瀉天數(shù)/(雞只總數(shù)×試驗天數(shù))。

1.7.2 飼料和糞便中常規(guī)營養(yǎng)成分測定

采用全收糞法收集第19～21天的排泄物。小心去除毛、皮屑和雜物后將每天的排泄物混勻，滴加10%鹽酸以固定氮，冷凍保存于-20℃冰箱中，試驗結束后混勻3 d收集的排泄物，65℃烘干并充分回潮，粉碎后測定糞樣中各項營養(yǎng)指標。飼料和糞樣中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、鈣和磷含量的測定分別按照 GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2002和 GB/T 6437—2002方法進行。飼料中AFB1含量測定按照 GB/T 17480—2008方法進行。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis) %

1.7.3 肉雞腸道微生物數(shù)量測定

雞頸動脈放血處死后，剖腹取十二指腸、回腸、盲腸段食糜，置于5 mL滅菌離心管中。準確稱取0.5 g置于含有4.5 mL滅菌生理鹽水的10 mL離心管中，混合均勻，此時為10倍稀釋。從10倍稀釋液中準確吸取0.5 mL置于含有4.5 mL滅菌生理鹽水的10 mL離心管中，此時為100倍稀釋，按此方法將其稀釋至10-7。取適當稀釋度，用微量移液器吸取0.1 mL置于相應固體培養(yǎng)基中(每個稀釋度2個重復)，涂布均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其中大腸桿菌數(shù)量測定采用伊紅美藍培養(yǎng)基，37℃有氧條件下培養(yǎng)48 h;乳酸菌數(shù)量測定采用MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。選取菌落數(shù)在10～100個的平皿進行計數(shù)，結果換算為每克內(nèi)容物所含菌落數(shù)的對數(shù)［lg(CFU/g)］。

1.7.4 血清和肝臟生化指標的測定

從每個重復中選擇體重中等的雞頸動脈采血，每只采血5 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清，使用全自動血液生化自動分析儀測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷酰轉肽酶(GH)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、膽堿酯酶(CHE)活性及總蛋白、白蛋白、球蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、肌酐、葡萄糖、尿酸、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白含量。血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SAS 6.12統(tǒng)計軟件中ANOVA過程進行方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞生長性能的影響

從表2可以看出，E組平均日采食量和平均日增重均顯著高于 B組(P＜0.05)，分別提高了11.59%和16.87%，但與對照組差異不顯著(P＞0.05)。各組雞只的腹瀉率均顯著低于B組(P＜0.05)，C、D、E 組分別降低了 53.36%、55.32%和56.58%。各組雞只的死亡率也顯著低于B組(P＜0.05)，C、D、E 組分別降低了 66.67%、77.78%和88.89%。

表2 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of dietary probiotics and AFB1degrading enzyme on growth performance of broilers(n=5)

2.2 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞營養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響

從表3可以看出，與B組相比，各組粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和磷的代謝率顯著提高(P＜0.05)，E組鈣的代謝率顯著高于B組(P＜0.05)。

2.3 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對腸道微生物數(shù)量的影響

從表4可以看出，飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶顯著降低了十二指腸中大腸桿菌的數(shù)量，并顯著提高了回腸和盲腸中乳酸菌的數(shù)量(P＜0.05)。

表3 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞營養(yǎng)物質(zhì)代謝率的影響Table 3 Effects of dietary probiotics and AFB1degrading enzyme on nutrient metabolic rates of broilers(n=5) %

2.4 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞血清生化指標的影響

從表5可以看出，E組血清間接膽紅素含量顯著高于B組(P＜0.05)，低密度脂蛋白含量顯著低于B組(P＜0.05)，其他生化指標各組無顯著差異(P＞0.05)。

2.5 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞血清酶活性的影響

從表6可以看出，各組血清谷酰轉肽酶活性顯著高于B組(P＜0.05);C、D、E組總抗氧化能力顯著高于B組(P＜0.05)，但與A組差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞生長性能的影響

霉菌毒素的污染給糧食生產(chǎn)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及飼料和食品加工企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［11］。動物生產(chǎn)中，威脅家禽生產(chǎn)的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素、嘔吐毒素和煙曲霉毒素等。王若軍等［12］對中國的飼料原料和配合飼料中霉菌毒素的調(diào)查結果顯示，有88%、84%、77%和60%的玉米中含有T-2毒素、黃曲霉毒素、煙曲霉毒素和赭曲霉毒素，且所有的玉米中均含有嘔吐霉素和玉米赤霉烯酮，90%以上的配合飼料中均含有6種以上的霉菌毒素。

表4 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞前期腸道微生物數(shù)量的影響Table 4 Effects of dietary probiotics and AFB1degrading enzyme on gut microbial number of broilers lg(CFU/g)

表5 飼糧中添加添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞血清生化指標的影響Table 5 Effects of dietary probiotics and AFB1degrading enzyme on serum biochemical indexes of broilers(n=5)

對于家禽來說，黃曲霉毒素能抑制家禽的生長、降低飼料轉化率、增加死亡率和降低產(chǎn)蛋量等，造成嚴重后果。王慧榮等［13］在肉雞飼料中添加450.6 μg/kg AFB1后，肉雞的平均日采食量和平均日增重與對照組相比均有顯著降低。曹紅等［14］報道，在 1～3 周齡飼糧中添加 100 μg/kg 的AFB1對肉仔雞的平均日采食量、平均日增重和末重均無顯著影響，但從飼喂全期看，AFB1可引起肉仔雞的平均日采食量、末重和平均日增重的下降。齊德生等［15］報道，肉仔雞采食含有 80 μg/kg AFB1的飼料7 d后料重比顯著下降。本試驗的基礎飼糧中AFB1含量高達178.79 μg/kg，因此肉雞的生長受到了嚴重的抑制，21日齡時最大體重僅為152.39 g。這說明在幼齡動物飼糧中，如果含有高劑量的AFB1，即便加入益生菌和AFB1降解酶也不能緩解黃曲霉毒素的危害。但是，本研究結果表明，益生菌和AFB1降解酶可顯著地降低肉仔雞的死亡率和腹瀉率，并提高飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，特別是高劑量添加益生菌和AFB1降解酶，可使肉仔雞的平均日增重明顯提高，這充分說明益生菌和AFB1降解酶起到了明顯的解毒作用。

3.2 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞腸道微生物數(shù)量的影響

微生態(tài)制劑進入動物機體后通過調(diào)節(jié)消化道菌群平衡、增加有益菌的數(shù)目、抑制病原菌的生長對動物產(chǎn)生益生作用，如提高機體的抗病能力和消化吸收能力及抑制有害菌的增殖等。周健等［16］報道，飼糧中添加乳酸菌和地衣芽孢桿菌可以抑制肉雞腸道中大腸桿菌的數(shù)量。Mohan等［17］研究表明，肉雞飼糧中添加益生菌顯著增加了乳酸菌的數(shù)量，降低了大腸桿菌的數(shù)量。本研究取得了與前人一致的結論，證明了益生菌在維持動物胃腸道微生物區(qū)系平衡和降低腹瀉率方面的作用。

3.3 飼糧中添加益生菌和AFB1降解酶對肉雞血清生化指標和酶活性的影響

動物血清生化指標的變化反映了機體的代謝狀況，本研究結果表明，除添加高添加量霉益生菌和AFB1降解酶可降低肉雞血清中低密度脂蛋白和提高間接膽紅素外，對整個肉雞群的其他血清生化指標無明顯影響，說明益生菌和AFB1降解酶可維持機體代謝的正常水平。一般而言，血清中低含量的低密度脂蛋白表明血清中膽固醇的轉運通暢，有利于機體健康;而高含量的間接膽紅素則預示著紅細胞的破損和肝功能異常，不過總膽紅素含量無明顯差異，說明膽紅素的代謝處于正常水平，有待于進一步研究。

另外，黃曲霉毒素能夠改變血清中各種酶類的活性，當肝臟等組織器官受到損傷時，許多種酶類會釋放出來進入血液中，使血清中多種酶的活性升高，因此血清中酶活性變化是評估動物組織和器官損傷程度的可靠依據(jù)。據(jù)報道，畜禽攝食含有黃曲霉毒素的飼料后，血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、乳酸脫氫酶、總膽紅素含量明顯升高［18-19］，這就是由于黃曲霉毒素在家禽肝臟中蓄積造成了家禽肝臟機能的紊亂和肝細胞受損所致。在本試驗中，盡管各組肉雞血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶等酶的活性沒有明顯的改變，但谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性要高于前人所報道的122.25和6.25 U/L［20］。這主要是由于長期大量攝入AFB1，導致肝臟代謝機能紊亂，使血清中相關酶的活性升高。在正常范圍內(nèi)，谷酰轉肽酶具有重要的生理功能，參與谷胱甘肽的代謝，對于氨基酸和蛋白質(zhì)的吸收、分布和合成是必不可少的。益生菌和AFB1降解酶可提高肉雞血清中谷酰轉肽酶活性，說明該解毒劑可緩解霉菌毒素對肝臟等器官的損傷作用，提高蛋白質(zhì)的合成能力。

在動物體內(nèi)，抗氧化劑和助氧化劑之間存在微妙的平衡，尤其是在細胞層面，這種平衡負責協(xié)調(diào)多種新陳代謝途徑，以維持免疫競爭、生長發(fā)育以及抗應激反應。機體抗氧化能力的強弱與健康程度存在密切聯(lián)系，抗氧化能力是機體抵抗腫瘤的重要機制之一。生物細胞內(nèi)有一套抗氧化的防御系統(tǒng)，該防御系統(tǒng)有酶促與非酶促2個體系。酶促體系主要包括，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉移酶和還原酶等;非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬硫蛋白等。防御系統(tǒng)的氧化防護作用主要通過清除自由基和活性氧、分解過氧化物和除去起催化作用的金屬離子3條途徑來實現(xiàn)［21］。

霉菌毒素對動物機體的危害之一就是對動物體內(nèi)抗氧化酶的影響。Choi等［22］發(fā)現(xiàn)老鼠血液中谷胱甘肽過氧化物酶活性的降低主要是因為AFB1在體內(nèi)的代謝。Rastogi等［23］以 2 mg/kg 體重向大鼠腹腔內(nèi)注射AFB1，結果顯示大鼠肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉移酶以及谷胱甘肽還原酶的活性顯著下降。本研究中，與B組相比，添加益生菌和AFB1降解酶的各組總抗氧化能力皆有顯著的提高，這可能是由于益生菌和AFB1降解酶提高了動物機體防御系統(tǒng)的氧化保護作用，同時部分降解了飼料的AFB1，消除或減弱了AFB1對動物機體的危害。

4 結 論

肉雞飼糧中添加0.05%～0.15%益生菌和AFB1降解酶的復合物可以顯著降低肉雞的腹瀉率和死亡率，并在一定程度上緩解AFB1對肉雞生長性能的不良影響。

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