王寶維 王 姣 葛文華 張名愛 岳 斌 徐晨晨 賈玉輝 史雪萍

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，青島 266109)

腸道為動物消化吸收的主要器官，對生長發(fā)育具有重要的作用。腸道的發(fā)育以及腸內(nèi)環(huán)境的狀況決定了營養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收的情況，進而影響到飼料的利用率。維生素B1是維持動物生長必不可少的一種水溶性維生素，它作為糖代謝中間產(chǎn)物丙酮酸氧化脫氫酶的組成部分，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)及胃腸功能［1］。當(dāng)動物缺乏維生素B1時，體內(nèi)糖代謝紊亂，血液及組織的糖代謝過程中就會產(chǎn)生丙酸和乳酸，二者積累會造成酸中毒［2］。維生素B1缺乏因阻斷了丙酮酸生成乙酰輔酶A而導(dǎo)致組織能量生成受阻，從而導(dǎo)致神經(jīng)纖維不能傳導(dǎo)神經(jīng)沖動，進而影響到消化系統(tǒng)的功能［3］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，維生素B1對動物的消化系統(tǒng)有一定的影響。孟昭聚等［4］研究發(fā)現(xiàn)，仔鵝缺乏維生素B1時，胃內(nèi)有炎癥，腸壁變薄，十二指腸潰瘍并有萎縮現(xiàn)象。徐存華等［5］剖檢維生素B1缺乏的青年母雞發(fā)現(xiàn)，肌胃角質(zhì)膜薄而干枯，呈深褐色，難剝離，小腸(特別是十二指腸)發(fā)生潰瘍，黏膜粗糙，腸壁變厚。王忠［6］也發(fā)現(xiàn)，綿羊缺乏維生素B1導(dǎo)致腸黏膜脫落，腸壁變薄，并伴有出血現(xiàn)象。Tafaj等［7］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧維生素B1水平與瘤胃液中維生素B1含量呈二次負相關(guān)，且瘤胃液中維生素B1含量與短鏈脂肪酸濃度呈正相關(guān)，與瘤胃pH呈負相關(guān)。迄今為止，關(guān)于動物維生素B1營養(yǎng)缺乏癥方面的研究較多，維生素B1對鵝營養(yǎng)物質(zhì)利用率、消化道發(fā)育、腸道微生物及組織學(xué)的影響未見系統(tǒng)報道，本試驗以5～15周齡肝用型青農(nóng)灰鵝為研究對象，探討飼糧中添加不同水平維生素B1對鵝營養(yǎng)物質(zhì)利用率、腸道形態(tài)及微生物菌群的影響，旨在進一步探明維生素B1與動物消化功能的關(guān)系，并為鵝飼糧中維生素B1營養(yǎng)需要量的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參照 NRC(1994)［8］家禽營養(yǎng)需要量設(shè)計配方?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。維生素 B1含量的測定采用 GB/T 14700—2002的方法。5～15周齡鵝基礎(chǔ)飼糧中維生素B1含量為0.80 mg/kg。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 飼養(yǎng)試驗設(shè)計

選擇5周齡體重相近的健康大型青農(nóng)灰鵝(法國米朗德、阿蒂蓋品種雜交配套選育而成)360只，隨機分為6個處理，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)10只鵝(公母各占1/2)。5～15周齡飼糧中維生素B1水平(基礎(chǔ)飼糧中維生素B1含量+添加量)分別為 0.8(Ⅰ組)、2.6(Ⅱ組)、4.4(Ⅲ組)、6.2(Ⅳ組)、8.0(Ⅴ組)、9.8 mg/kg(Ⅵ組)。Ⅰ組為對照組，試驗期為11周。

1.2.2 代謝試驗設(shè)計

在飼養(yǎng)試驗第12周齡時從每個重復(fù)中隨機抽取體重相近的健康鵝1只，每組6只，共36只，單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。預(yù)試期4 d，再禁食1 d，正式試驗飼喂3 d后，采用全收糞法按時收集3 d的糞便。再禁食2 d后連續(xù)3 d飼喂無氮飼糧(表2)，并每天收集排泄物作為內(nèi)源樣品進行內(nèi)源校正(在禁食12 h時適當(dāng)補充6%的葡萄糖水)。試驗期間，每天飼喂120 g飼糧，同時記錄剩料量，計算采食量。收集到的糞便要剔除其中的鵝毛及皮屑等雜物，再用10%的鹽酸固氮，放入烘箱中烘干，以便測定營養(yǎng)物質(zhì)利用率。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗鵝全期舍飼，自由采食和飲水，地面平養(yǎng)，少喂勤添。育雛期給予正常光照和溫度。每天記錄飼喂量、耗料量和死淘數(shù)等數(shù)據(jù)，觀察鵝的生長狀況，并按正常免疫程序進行免疫。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 營養(yǎng)物質(zhì)利用率測定

將糞樣放在65～75℃的烘箱中烘干，然后再在自然狀態(tài)下回潮24 h制成風(fēng)干樣，最后用小型粉碎機將干糞粉碎，置于干燥器中保存待測。

表2 無氮飼糧組成Table 2 Composition of nitrogen-free diet %

1.4.2 腸道形態(tài)的測定

飼養(yǎng)試驗的15周齡末時，從每個重復(fù)組中分別抽取2只，共測定72只，抽測的鵝體重接近該組平均體重，稱重后放血屠宰，迅速剖開腹腔，摘取全部消化道，并按十二指腸、空腸、回腸、盲腸(單側(cè))的順序測量各段長度。按下列公式計算腸長指數(shù)和腸體指數(shù):

腸長指數(shù)(%)=［腸長(cm)/體斜長(cm)］×100;

腸體指數(shù)(mg/g)=腸重(mg)/活體重(g)。

1.4.3 微生物的測定

取15周齡末處死的試驗鵝，分別取1 g盲腸內(nèi)容物于盛有9 mL滅菌稀釋液的滅菌試管中，用漩渦振蕩器混勻，制成10-1稀釋液，然后用微量移液器移取1 mL該稀釋液于另一盛有9 mL滅菌稀釋液的試管中，振蕩混勻，制成10-2稀釋液，依次進行稀釋，得到10-3～10-6稀釋液，每個稀釋度各3滴分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個梯度設(shè)2個重復(fù)，其中大腸桿菌采用伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)，雙歧桿菌采用雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基(BBL培養(yǎng)基)，乳酸桿菌采用乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)。大腸桿菌37℃需氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)，雙歧桿菌和乳酸桿菌35℃厭氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)，以30～300個菌落的稀釋度作為計數(shù)用。細菌數(shù)量采用平板菌落計數(shù)法進行統(tǒng)計，按公式(每克腸道內(nèi)容物中細菌數(shù)量=菌落數(shù)×滴數(shù)×稀釋倍數(shù))計算出每克內(nèi)容物中的細菌數(shù)量，最后以每克腸道內(nèi)容物中細菌個數(shù)的對數(shù)值［lg(CFU/g)］表示。

1.4.4 切片制作方法

取15周齡末處死的試驗鵝，在空腸中段處剪下約1 cm的腸段，用0.9%的生理鹽水洗凈后放入10%的甲醛固定液中固定。將固定好的小腸組織修理后用乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋進行切片，最后用蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察并照相。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0中單因素方差分析中的LSD法進行多重比較。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B1對鵝營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響

由表3可知，各組間干物質(zhì)(DM)、有機物(OM)和中性洗滌纖維(NDF)利用率差異不顯著(P＞0.05)。粗蛋白質(zhì)(CP)利用率Ⅲ組顯著高于對照組(P＜0.05);粗脂肪(EE)利用率Ⅳ組顯著高于對照組(P＜0.05);粗纖維(CF)利用率Ⅳ、Ⅴ組極顯著高于對照組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組均顯著高于對照組(P＜0.05);酸性洗滌纖維(ADF)利用率Ⅱ組顯著高于對照組(P＜0.05);鈣(Ca)利用率Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組極顯著高于對照組(P＜0.01)，Ⅴ組顯著高于對照組(P＜0.05);磷(P)利用率Ⅲ組顯著高于對照組(P＜0.05)，其他各組與對照組間均差異不顯著(P＞0.05)。當(dāng)維生素 B1水平為2.6 mg/kg時，ADF和Ca的利用率均達到最高;當(dāng)維生素B1水平為4.4 mg/kg時，CP和P的利用率均達到最高;當(dāng)維生素B1水平為6.2 mg/kg時，EE和CF的利用率均達到最高。

由此表明，飼糧中添加不同水平維生素B1能夠極顯著提高鵝對飼糧中CF和Ca的利用率，顯著提高CP、EE、ADF和P的利用率。

2.2 維生素B1對鵝腸道形態(tài)的影響

2.2.1 腸長指數(shù)

由表4可知，15周齡時，Ⅴ組十二指腸腸長指數(shù)最大，顯著高于對照組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05);Ⅴ組空腸腸長指數(shù)最大，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)。Ⅳ組回腸腸長指數(shù)最大，Ⅳ、Ⅴ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅳ組盲腸腸長指數(shù)最大，顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)。

由此表明，飼糧中添加6.2～8.0 mg/kg維生素B1對腸道腸長指數(shù)有顯著影響。

表3 維生素B1對鵝營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響表3 Effects of vitamin B1on nutrient digestibility of geese %

表4 維生素B1對鵝腸道腸長指數(shù)的影響Table 4 Effects of vitamin B1on intestinal length index of geese %

2.2.2 腸體指數(shù)

由表5可知，15周齡時，Ⅳ組十二指腸腸體指數(shù)最大，Ⅳ組極顯著高于對照組(P＜0.01)，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組顯著高于對照組(P＜0.05);Ⅴ組空腸腸體指數(shù)最大，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組顯著高于對照組(P＜0.05)，Ⅴ組極顯著高于對照組(P＜0.01);Ⅴ組回腸腸體指數(shù)最大，Ⅲ、Ⅴ組極顯著高于對照組(P＜0.01);盲腸腸體指數(shù)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ組顯著高于對照組(P＜0.05)。

由此表明，飼糧中添加不同水平的維生素B1對各種腸體指數(shù)有不同程度的影響。

2.3 維生素B1對鵝盲腸微生物菌群的影響

由表6可知，15周齡時，Ⅲ組大腸桿菌數(shù)量最少，Ⅲ、Ⅳ組極顯著低于對照組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅴ組顯著低于對照組(P＜0.05);Ⅴ組雙歧桿菌數(shù)量最多，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ組顯著高于對照組(P＜0.05);Ⅱ組乳酸桿菌數(shù)量最多，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組顯著高于對照組(P＜0.05)。

由此表明，飼糧中添加適宜水平維生素B1對盲腸中大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量有顯著影響。

表5 維生素B1對鵝腸道腸體指數(shù)的影響Table 5 Effects of vitamin B1on intestinal body index of geese mg/g

表6 維生素B1對鵝盲腸微生物菌群的影響Table 6 Effects of vitamin B1on microbial flora in cecum of geese lg(CFU/g)

2.4 腸道組織形態(tài)

2.4.1 空腸絨毛形態(tài)

由表7可知，15周齡時，Ⅲ組絨毛高度最高，Ⅲ、Ⅳ組顯著高于對照組(P＜0.05);腸壁厚度Ⅲ組顯著低于對照組(P＜0.05);隱窩深度Ⅲ組極顯著低于對照組(P＜0.01)，Ⅳ組顯著低于對照組(P＜0.05);Ⅲ組絨毛高度/隱窩深度最高，Ⅲ組極顯著高于對照組(P＜0.01)。

表7 維生素B1對鵝空腸絨毛形態(tài)的影響Table 7 Effects of vitamin B1on jejunum villi shape of geese

2.4.2 空腸絨毛組織學(xué)切片

采用日本OLYMPUS生物顯微鏡(10×10倍)對15周齡空腸絨毛組織切片進行觀察，其組織結(jié)構(gòu)變化情況見圖1。

由圖1可以看出，對照組空腸絨毛細且短，長度Ⅱ～Ⅵ組均短，且隱窩較深、腸壁較厚。Ⅱ～Ⅴ組絨毛較長且排列整齊、隱窩較淺、腸壁較薄。

腸道組織形態(tài)表明，飼糧中維生素B1水平為2.6～8.0 mg/kg時對15周齡鵝腸道發(fā)育具有顯著影響，進而影響鵝的消化生理活動，調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

2.5 空腸絨毛形態(tài)與營養(yǎng)物質(zhì)利用率的相關(guān)性

由表8可知，鵝空腸絨毛高度與 DM、OM、CP、EE、CF、NDF、Ca、P 的利用率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01);腸壁厚度與 DM、CP、ADF 和 Ca的利用率呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，與P的利用率呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01);隱窩深度與DM、OM、CP、EE、NDF和 P的利用率呈極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，與CF和Ca的利用率呈顯著負相關(guān)(P＜0.05);除ADF外，絨毛高度/隱窩深度與飼糧各營養(yǎng)物質(zhì)利用率均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

圖1 空腸絨毛組織切片F(xiàn)ig.1 Jejunal villi tissue slice

表8 鵝空腸絨毛形態(tài)與營養(yǎng)物質(zhì)利用率的相關(guān)性Table 8 Correlation between jejunum villi shape and nutrient digestibility of geese

由此表明，飼糧中添加不同水平維生素B1可對鵝的腸道形態(tài)變化和營養(yǎng)物質(zhì)利用率產(chǎn)生顯著影響。鵝腸道的形態(tài)變化與飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率密切相關(guān)。

3 討論

3.1 維生素B1對鵝飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響

家禽飼糧常規(guī)營養(yǎng)成分的評定主要是測定飼糧中 DM、OM、CP、EE、CF、NDF、ADF、Ca、P 等營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況。目前，關(guān)于維生素B1添加水平對畜禽飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率影響的研究未見系統(tǒng)報道。本研究結(jié)果表明，不同水平維生素B1對鵝DM、OM和NDF的利用率無顯著影響，但對CP、EE、CF、ADF、Ca、P 的利用率均有顯著影響，表明適宜水平維生素B1能夠促進鵝對飼糧中CP、EE、CF、ADF、Ca、P 的利用。分析其主要機制有以下2點:1)維生素B1在小腸上部可被吸收，吸收后的維生素B1在肝臟被磷酸化。維生素B1的磷酸化形式包括硫胺素一磷酸(TMP)、硫胺素焦磷酸(TPP)以及硫胺素三磷酸(TTP)。焦磷酸硫胺素能促進重要的神經(jīng)介質(zhì)乙酰膽堿的合成，抑制膽堿酯酶對乙酰膽堿分解。增加維生素B1時，乙酰膽堿合成增加，同時由于膽堿酯酶活性的降低，乙酰膽堿的分解減緩，神經(jīng)傳導(dǎo)活躍，加強了消化系統(tǒng)的功能。如胃腸蠕動加快，食物通過胃腸的時間加速，消化酶分泌增加，消化機能加強，從而提供了鵝的飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率。2)據(jù)王嬌等［9］研究結(jié)果表明，維生素B1顯著提高鵝肝臟中硫胺焦磷酸激酶(TPK1)基因的表達量，且TPK1基因的表達量與胃蛋白酶、胰臟脂肪酶、腸淀粉酶活性呈極顯著正相關(guān);各種消化酶活性的增加，有利于營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，導(dǎo)致飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率的提高。關(guān)于維生素B1改善鵝飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率的化學(xué)信號通路還需要進一步深入研究。

3.2 維生素B1對鵝消化道發(fā)育的影響

腸道的發(fā)育尤其是腸黏膜的正常結(jié)構(gòu)與功能是營養(yǎng)物質(zhì)充分消化與吸收的基本保證。而腸重、腸體指數(shù)等指標(biāo)在一定程度上可以反映腸道的生長發(fā)育狀況［10］。黃慧華［11］研究表明，維生素B1能促進幼健鯉腸道的生長和發(fā)育。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加2.6～8.0 mg/kg維生素B1顯著提高15周齡的十二指腸、空腸、回腸、盲腸的腸長指數(shù)和腸體指數(shù)，與上述有關(guān)文獻研究結(jié)果相同。本試驗結(jié)果表明，維生素B1對5～15周齡鵝腸道形態(tài)變化有顯著影響。由于維生素B1促進了后備種鵝腸道良好的發(fā)育，將有利于產(chǎn)蛋期營養(yǎng)的消化吸收，并對生產(chǎn)性能和繁殖性能產(chǎn)生良好影響，此結(jié)果對指導(dǎo)種鵝生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。關(guān)于維生素B1促進鵝腸道發(fā)育的機制比較復(fù)雜，還需要進一步深入研究。

3.3 維生素B1對盲腸微生物菌群的影響

動物消化系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，部分依賴于腸道中寄生的微生物菌群分布及其總量;飼糧成分和營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化對腸道微生物菌群數(shù)量有顯著的影響［12］。而盲腸又是消化道微生物活動最多和最適宜的器官，其中厭氧菌占主導(dǎo)地位(主要是雙歧桿菌、乳酸桿菌等)［13］。Wang等［14］研究表明，雙歧桿菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌是成年鵝腸道的優(yōu)勢菌群，盲腸段極顯著高于其他腸段。Liu等［15］研究表明，通過16s RNA基因序列分析在盲腸內(nèi)容物中，芽孢桿菌是第一大優(yōu)勢菌群，占58.7%;擬桿菌是第二大優(yōu)勢菌群，占26.9%。鵝能夠通過盲腸微生物發(fā)酵利用飼糧中的部分CF，腸道蠕動使小腸內(nèi)容物進入盲腸，逆蠕動則使直腸內(nèi)容物倒流入盲腸，盲腸本身緩慢蠕動與逆蠕動使內(nèi)容物得以充分混合，為微生物發(fā)酵作用創(chuàng)造了良好條件［16］。只有腸道內(nèi)微生物有益菌群和有害菌群的種類和數(shù)量處于平衡狀態(tài)才能夠保證動物消化道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而提高動物的消化能力和飼料利用率。

本研究結(jié)果表明，15周齡時，適宜水平維生素B1能極顯著降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，顯著增加雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量;維生素B1水平為4.4 mg/kg時，大腸桿菌數(shù)最少，維生素B1水平分別為8.0、2.6 mg/kg時，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)最多。結(jié)果表明，飼糧中維生素B1適宜水平能夠改善5～15周齡鵝盲腸內(nèi)微生物環(huán)境，增加雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的繁殖速度，優(yōu)化了腸道優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu);同時抑制大腸桿菌等有害菌的繁殖，降低了有害菌的數(shù)量，從而提高了機體健康水平，促進了飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。關(guān)于腸道菌群代謝產(chǎn)物對機體營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響機制還有待于繼續(xù)研究。

3.4 維生素B1對空腸絨毛形態(tài)的影響

絨毛高度影響小腸吸收面積，絨毛高度越高，越利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隱窩深度反映細胞的生成率，隱窩越淺，細胞成熟率越高，分泌功能越強。絨毛高度/隱窩深度則綜合反映小腸的功能狀態(tài)，比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴隨腹瀉的發(fā)生;比值上升，表示消化吸收能力增強，腹瀉率下降［17］。

本研究結(jié)果表明，飼糧中維生素B1水平在2.6～8.0 mg/kg時，能夠顯著增加15周齡鵝空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，并顯著降低隱窩深度和腸壁厚度。表明適量的維生素B1水平能夠改善5～15周齡鵝的腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而間接改善鵝的營養(yǎng)物質(zhì)利用率和生長發(fā)育。關(guān)于維生素B1對鵝腸道組織形態(tài)影響和維生素在機體內(nèi)的協(xié)同或拮抗作用機制還有待于繼續(xù)研究。

4 結(jié)論

① 飼糧中添加2.6～6.2 mg/kg維生素B1能夠極顯著提高鵝對飼糧中CF和Ca的利用率，顯著提高CP、EE、ADF和P的利用率。

②飼糧中添加不同水平維生素B1對各種腸腸長指數(shù)和腸體指數(shù)有不同程度顯著影響。

③ 飼糧中添加2.6～8.0 mg/kg維生素B1能夠促進腸道形態(tài)的變化和有益微生物菌群的增殖。

④空腸絨毛形態(tài)與營養(yǎng)物質(zhì)利用率顯著相關(guān)。

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