李 杰 伍樹(shù)松 熊興耀 蘇丁丁* 賀建華*

博落回系罌粟科博落回屬，在我國(guó)分布廣泛、資源豐富。其主要生物活性成分為博落回生物堿，均屬異喹啉衍生物類［1］。血根堿(sanguinarine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)、原阿片堿(protopine)、別隱品堿(α-allocryptopine)是4種主要的博落回生物堿，在博落回中發(fā)揮主要生理功能［2］。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，博落回生物堿能顯著提高早期斷奶仔豬的生長(zhǎng)，降低料重比，減少斷奶應(yīng)激反應(yīng)［3-5］;此外，研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加博落回生物堿能顯著提高火雞的生長(zhǎng)性能［6］。但在細(xì)胞水平研究博落回生物堿對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)影響的還很少。為此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外培養(yǎng)豬腸道上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1)，探討血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿在不同濃度、不同時(shí)間段對(duì)IPEC-1增殖的影響，為博落回生物堿對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的促進(jìn)作用以及腸道疾病的預(yù)防與治療提供了新的理論依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

IPEC-1由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物生態(tài)營(yíng)養(yǎng)健康養(yǎng)殖研究中心惠贈(zèng)。

1.1.2 主要藥品與試劑

血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心提純，純度均大于98%［7］。4-甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)購(gòu)自Sigma公司。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)自Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)基HAM’S/F-12、胎牛血清(FBS)、杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)為Hyclone公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-1培養(yǎng)在盛有適量HAM’S/F-12培養(yǎng)基(含5%FBS、1%雙抗、0.1%ITS 和 5 μg/L EGF)的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2飽和濕度)內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，試驗(yàn)組在普通培養(yǎng)基中加入不同濃度(高濃度組分別是 4、2、1、0.5、0.25 μg/mL 的血根堿或白屈菜紅堿，100、50、25μg/mL的原阿片堿或別隱品堿;低濃度組分別是 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 μg/mL 的血根堿或白屈菜紅堿，25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 的原阿片堿或別隱品堿。初期濃度劃分參照以往研究［8］設(shè)定，而后根據(jù)博落回生物堿對(duì)IPEC-1的抑制及增殖作用區(qū)分)的博落回生物堿進(jìn)行培養(yǎng)，各組不同濃度梯度均設(shè)8個(gè)重復(fù)。博落回生物堿溶于DMSO之后用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度低于0.1%。

1.2.3 MTT 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-1用D-PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，加入HAM’S/F-12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板內(nèi)，前培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)基100μL，試驗(yàn)組加入含不同濃度博落回生物堿的培養(yǎng)基100μL，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)12或24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10μL，4 h后終止培養(yǎng)，每孔加入0.065 4 mol/L鹽酸異丙醇溶液 100μL，吹打后振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值(OD)。細(xì)胞活率計(jì)算公式如下:

細(xì)胞活率(%)={1-［(對(duì)照組OD-試驗(yàn)組 OD)/對(duì)照組 OD］}×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel進(jìn)行初步處理后，用SPSS 19數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(SPSS 19，IBM公司，美國(guó))進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)3次以上重復(fù)試驗(yàn)。顯著性分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用鄧肯氏法多重比較(Duncan’s Multiple Range test)。P＜0.05 表示為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 高濃度博落回生物堿對(duì)IPEC-1增殖的影響

為探討4種博落回生物堿對(duì)IPEC-1的毒性影響，本試驗(yàn)首先使用了較高濃度的博落回生物堿處理IPEC-1。不同濃度的血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿處理IPEC-1 12 h后，通過(guò)MTT染色檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果如表1、表2所示，高濃度的博落回生物堿能抑制IPEC-1的生長(zhǎng)。本研究中，0.25～4 μg/mL 的血根堿、0.25～4 μg/mL的白屈菜紅堿、100μg/mL的原阿片堿或100μg/mL的別隱品堿對(duì)IPEC-1的增殖有顯著的抑制作用(P＜0.05)。隨著濃度的降低，這種抑制趨勢(shì)隨之減弱，25～50μg/mL的原阿片堿和別隱品堿對(duì)IPEC-1的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且具有一定的上升趨勢(shì)。

2.2 低濃度博落回生物堿對(duì)IPEC-1增殖的影響

為探討低濃度博落回生物堿對(duì)IPEC-1增殖的影響，本試驗(yàn)隨后降低了博落回生物堿的處理濃度。結(jié)果如表3、表4所示，IPEC-1經(jīng)低濃度的血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿或別隱品堿處理12 h后，細(xì)胞數(shù)目增加，其中 0.006 25～0.1 μg/mL 的血根堿、0.006 25～0.1 μg/mL 的白屈菜紅堿、3.125～ 25 μg/mL 的 原 阿 片 堿 或 1.562 5 ～25μg/mL的別隱品堿對(duì)IPEC-1增殖具有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)。隨著博落回生物堿濃度的不斷下降，這種促進(jìn)作用又慢慢減弱，由表3、表4可知，血根堿對(duì)IPEC-1增殖的促進(jìn)作用在0.012 5μg/mL時(shí)達(dá)到峰值，白屈菜紅堿、原阿片堿 和 別 隱 品 堿 則 分 別 為 0.025、6.25 和12.5 μg/mL，1.562 5 μg/mL 的 原 阿 片 堿 處 理IPEC-1 12 h對(duì)細(xì)胞無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表2 高濃度原阿片堿和別隱品堿對(duì)IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 2 Effects of high concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

表3 低濃度血根堿和白屈菜紅堿對(duì)IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 3 Effects of low concentrations of sanguinarine and chelerythrine on IPEC-1 proliferation(cell viability) %

2.3 延長(zhǎng)博落回生物堿處理時(shí)間對(duì) IPEC-1增殖的影響

為探討博落回生物堿促進(jìn)IPEC-1增殖的作用周期，本試驗(yàn)通過(guò)延長(zhǎng)低濃度博落回生物堿對(duì)IPEC-1的作用時(shí)間，觀察其對(duì)IPEC-1的影響。結(jié)果如表3、表4所示，IPEC-1細(xì)胞經(jīng)低濃度博落回生物堿處理24 h后，細(xì)胞密度與對(duì)照組差異減少，僅0.1μg/mL的白屈菜紅堿、25μg/mL的原阿片堿和25μg/mL的別隱品堿表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)，其余各組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

博落回生物堿因其具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤、改善肝功能、增強(qiáng)免疫力等多方面的藥理作用而備受關(guān)注［9］，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明博落回生物堿還能有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。研究發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿具有促生長(zhǎng)作用的主要原因可能是通過(guò)與腸道接觸而發(fā)揮抗菌和抗炎作用［10］，從而降低斷奶仔豬腹瀉率、保障腸道健康。而Lenfeld等［11］研究認(rèn)為，博落回中含有的四苯并菲陡生物堿具有抑制膽堿脂酶活性、刺激唾液分泌、利尿、外周抗腎上腺素解交感作用［12］和通過(guò)抑制芳香族氨基酸脫羧酶來(lái)調(diào)節(jié)色氨酸-5-羥色胺代謝途徑，而增加飼養(yǎng)動(dòng)物的采食量［13］，這2種作用的結(jié)合是它提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能的原因。

表4 低濃度原阿片堿和別隱品堿對(duì)IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響Table 4 Effects of low concentrations of protopine and allocryptopine on IPEC-1 proliferation(cell viability)

本試驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)IPEC-1，探討了博落回生物堿對(duì)在豬腸上皮細(xì)胞增殖的影響，以期為探討博落回生物堿對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響提供新的研究思路。IPEC-1是分離自未吮乳的新生仔豬小腸上皮細(xì)胞，屬于非轉(zhuǎn)化性最初的連續(xù)培養(yǎng)小腸細(xì)胞系，具有典型的豬小腸上皮細(xì)胞特性［14］，而小腸(包括十二指腸、空腸與回腸)是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最主要的消化、吸收器官，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解后通過(guò)小腸吸收進(jìn)入血液和淋巴液，進(jìn)而參與機(jī)體代謝［15］。有研究表明，腸上皮細(xì)胞的增殖與腸黏膜重量和絨毛高度的改變有著緊密的聯(lián)系，而小腸絨毛高度的增加是小腸吸收功能增強(qiáng)的重要標(biāo)志［16］。因此，腸上皮細(xì)胞的增殖可以增強(qiáng)小腸的消化、吸收、免疫屏障等功能，并提高應(yīng)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的能力，進(jìn)而提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。

研究表明，博落回生物堿能夠?qū)?xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等膜性結(jié)構(gòu)造成破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。本研究中，IPEC-1經(jīng)高濃度的博落回生物堿處理后，細(xì)胞活率顯著下降，這在一定程度上印證了博落回生物堿的細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)處理濃度降低時(shí)，博落回生物堿不僅未體現(xiàn)出對(duì)IPEC-1的毒性作用，反而促進(jìn)了該細(xì)胞的增殖，隨著濃度的進(jìn)一步降低，這種促進(jìn)作用又逐漸減弱。此外，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，博落回生物堿對(duì)IPEC-1增殖的促進(jìn)作用也隨之減弱。這在一定程度上表明，博落回生物堿對(duì)IPEC-1可能具有某種營(yíng)養(yǎng)作用，能參與細(xì)胞的代謝。濃度范圍內(nèi)有顯著的增殖作用，說(shuō)明其提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能可能是通過(guò)促進(jìn)小腸細(xì)胞增殖分化更新，來(lái)增強(qiáng)小腸消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等作用的途徑實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

①高濃度的博落回生物堿對(duì)IPEC-1的增殖有顯著的抑制作用，其細(xì)胞毒性的濃度分別為血根堿＞0.25 μg/mL，白屈菜紅堿＞0.25 μg/mL，原阿片堿＞100μg/mL，別隱品堿＞100μg/mL。

②低濃度的博落回生物堿對(duì)IPEC-1的增殖有顯著的促進(jìn)作用，且具有一定的濃度范圍。其中血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿濃度分別在 0.012 5、0.025、6.25 和 12.5 μg/mL 時(shí)對(duì)IPEC-1增殖的促進(jìn)作用達(dá)到峰值。

③博落回生物堿對(duì)IPEC-1的增殖具有一定的作用周期。

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