唐 凌 孫崇巖 鄺聲耀 馮 琳，3 周小秋，3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，溫江 611130;2.四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物營養(yǎng)研究所，成都 610099;3.魚類營養(yǎng)與安全生產(chǎn)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

色氨酸為普通鯉魚等多種水生動(dòng)物的必需氨基酸［1］，同時(shí)是玉米蛋白粉和小麥蛋白粉等植物性蛋白質(zhì)源中除賴氨酸和蛋氨酸外最重要的限制性氨基酸［2］。外源添加氨基酸是保證飼料氨基酸平衡的有效措施，但有關(guān)水生動(dòng)物對合成氨基酸利用效果的報(bào)道存在差異。涂永鋒等［3］研究表明，在缺乏異亮氨酸的血粉飼料中加入晶體異亮氨酸后促進(jìn)了鯽魚的生長;而王冠等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在賴氨酸和蛋氨酸缺乏的飼料中加入晶體賴氨酸和晶體蛋氨酸后對異育銀鯽的生長無促進(jìn)作用;此外，相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)鯉魚［5］、斑點(diǎn)叉尾［6］等水生動(dòng)物對游離晶體氨基酸的利用效率低于對與蛋白質(zhì)結(jié)合氨基酸的利用效率。魚類對外源添加晶體氨基酸的利用效果不確定的原因通常認(rèn)為是由晶體氨基酸的吸收速度過快，導(dǎo)致與蛋白質(zhì)來源氨基酸的利用不同步［7］引起的，故對晶體氨基酸進(jìn)行包膜處理是改善其利用效果的有效途徑。目前，在水生動(dòng)物上關(guān)于色氨酸的研究主要集中在單一形式的色氨酸對其生長性能的影響上，未見晶體色氨酸和包膜色氨酸對水生動(dòng)物生長性能、蛋白質(zhì)代謝和消化吸收能力影響的比較研究。因此，本試驗(yàn)旨在比較研究晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉生長性能、蛋白質(zhì)代謝、消化吸收能力的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中色氨酸的使用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用晶體色氨酸(L-色氨酸)和包膜色氨酸(包膜材料為乙基纖維素)均由四川省畜科飼料有限公司提供。參考Teshima等［8］的方法，用高效液相色譜(HPLC)法測定晶體色氨酸和包膜色氨酸中色氨酸的含量分別為97.21%和32.46%。

1.2 試驗(yàn)飼料

以酪蛋白和明膠為主要蛋白質(zhì)源，分別以晶體色氨酸和包膜色氨酸為色氨酸源配制2種試驗(yàn)飼料，并使得2種試驗(yàn)飼料的色氨酸含量均為0.25%［參考NRC(1993)鯉魚色氨酸需要量］。試驗(yàn)飼料中除色氨酸以外的其他必需氨基酸模仿32%全卵雞蛋蛋白中的氨基酸模式［9］添加，吡哆醇［10］、泛酸［11］、肌醇［12］和核黃素［13］參考本實(shí)驗(yàn)室得出的幼建鯉相關(guān)營養(yǎng)的需要量，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、有效磷、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、微量元素和其余維生素參照NRC(1993)鯉魚營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)飼料經(jīng)逐步添加6.0 mol/L的氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整 pH至 7.0，制成顆粒料，儲藏于-20℃的冰柜中備用。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所水生動(dòng)物營養(yǎng)試驗(yàn)場進(jìn)行。魚苗購自四川雅安魚苗孵化場，魚苗購回后進(jìn)行30 d的馴養(yǎng)后開始正式飼養(yǎng)試驗(yàn)。選擇初始體重為(7.73±0.03)g的健康幼建鯉300尾，隨機(jī)分成2組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾，組間初始體重差異不顯著(P＞0.05)。2組試驗(yàn)魚分別飼喂添加晶體色氨酸和包膜色氨酸的試驗(yàn)飼料。采用連續(xù)充氧的循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行養(yǎng)殖，放養(yǎng)于水族箱(長 ×寬 ×高 =90 cm×30 cm×40 cm)中。試驗(yàn)魚每天飼喂6次，飼喂時(shí)間分別為 08:00、10:30、13:00、15:30、18:00、20:30，試驗(yàn)期60 d。試驗(yàn)期間定期檢查水質(zhì)，水體定期消毒，每天日光燈光照12 h，水溫和pH分別保持在(25±3)℃和7.0±0.3。

1.4 樣品收集及指標(biāo)測定

每箱魚在試驗(yàn)開始前和試驗(yàn)結(jié)束后分別稱重，并記錄試驗(yàn)期間每箱魚的攝食量。試驗(yàn)開始前在試驗(yàn)魚中隨機(jī)選擇20尾魚-70℃保存用于初始魚體成分的分析，試驗(yàn)結(jié)束后每箱隨機(jī)選擇5尾魚-70℃保存用于終末魚體成分分析，魚體成分分析方法參考AOAC(1998)［14］的方法。最后1次飼喂6 h后，按照飼喂先后順序每箱隨機(jī)選擇5尾魚尾靜脈采血，一部分放置在用肝素鈉預(yù)先處理的離心管中，4℃離心(3 000×g)15 min后分離血漿并立即測定血漿中氨濃度，另一部分血樣裝在離心管中置于4℃冰箱中靜置過夜，第2天4℃離心(3 000×g)15 min分離血清，進(jìn)行分裝后-20℃保存待測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的活力。試驗(yàn)結(jié)束并饑餓12 h后每箱隨機(jī)選擇15尾魚解剖，分離腸道、肝胰臟和肌肉，分別稱重后在液氮中快速冷凍，并保存在-70℃的冰箱中，用于腸道、肝胰臟蛋白質(zhì)含量以及腸道、肝胰臟和肌肉相關(guān)酶活力指標(biāo)的測定。每箱另隨機(jī)選擇5尾魚，分離其腸道，參照Lin等［15］的方法測定其腸長和腸道皺襞高度。

以冰凍的生理鹽水為勻漿介質(zhì)，用超聲波分別粉碎腸道、肝胰臟和肌肉樣品，然后離心(6 000×g，4℃)20 min，收集上清液用于測定腸道、肝胰臟和肌肉相關(guān)酶活力。胰蛋白酶活力的測定參考Hummel［16］的方法，脂肪酶和淀粉酶活力的測定參考 Furné等［17］的方法。堿性磷酸酶(AKP)、γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)和 Na+，K+-ATP酶(Na+，K+-ATPase)活力的測定分別參考Bessey 等［18］、Rosalki 等［19］和 McCormia［20］的 方法。腸道和肝胰臟的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。肝胰臟、肌肉和血清中GOT和GPT的活力均采用試劑盒(由BITKT臨床試劑有限公司提供)進(jìn)行測定，血漿中氨濃度的測定采用酶兩點(diǎn)法(試劑盒由中生北控試劑有限公司提供)。參考López-Alvarado等［21］的方法分別測定晶體色氨酸和包膜色氨酸在 15、30、45、60、75、90、105、120、180和240 min時(shí)的體外釋放速率。

1.5 計(jì)算公式

飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=攝食量(g)/增重(g);

特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×［ln終末體重(g)-ln初始體重(g)］/試驗(yàn)天數(shù)(d);

蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio，PER)=增重(g)/蛋白質(zhì)攝入量(g);

蛋白質(zhì)沉積率(protein retention rate，PRR，%)=100×體蛋白質(zhì)增量(g)/蛋白質(zhì)攝入量(g);

脂肪沉積率(lipid retention rate，LRR，%)=100×體脂肪增量(g)/脂肪攝入量(g);

肝體指數(shù)(hepatosomatic index，HSI，%)=100×肝胰臟重量(g)/體重(g);

腸體指數(shù)(intestosomatic index，ISI，%)=100×腸道重量(g)/體重(g);

腸長指數(shù)(intestinal length index，ILI，%)=100×腸道長(cm)/體長(cm)。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) g/kg

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較組間的差異顯著性，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉生長性能影響的比較

由表2可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的終末體重、特定生長率、蛋白質(zhì)效率、蛋白質(zhì)沉積率和脂肪沉積率(P＜0.05)，顯著降低了飼料系數(shù)(P＜0.05)，但二者對攝食量的影響差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)影響的比較

由表3可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著降低了血漿氨濃度以及肌肉和肝胰臟中GPT和GOT活力(P＜0.05)，但二者對血清中GOT和GPT活力的影響差異不顯著(P＞0.05)。

表2 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉生長性能影響的比較Table 2 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on growth performance of juvenile Jian carp

表3 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)影響的比較Table 3 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on related indices of protein metabolism of juvenile Jian carp

2.3 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉消化吸收能力影響的比較

2.3.1 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道和肝胰臟生長發(fā)育指標(biāo)影響的比較

由表4可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的腸長指數(shù)、腸體指數(shù)和肝體指數(shù)(P＜0.05)，顯著增加了腸道和肝胰臟蛋白質(zhì)含量(P＜0.05)。

表4 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道和肝胰臟生長發(fā)育指標(biāo)影響的比較Table 4 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on growth and development indices of intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp %

2.3.2 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道皺襞高度影響的比較

由表5可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的前腸、中腸、后腸皺襞高度(P＜0.05)。

表5 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道皺襞高度影響的比較Table 5 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on intestinal fold height of juvenile Jian carp μm

2.3.3 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道和肝胰臟消化酶活力影響的比較

由表6可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的腸道和肝胰臟胰蛋白酶和脂肪酶活力(P＜0.05)，但二者對腸道和肝胰臟淀粉酶活力的影響差異不顯著(P＞0.05)。

表6 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道和肝胰臟消化酶活力影響的比較Table 6 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on digestive enzyme activities in intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp U/g

2.3.4 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道刷狀緣酶活力影響的比較

由表7可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉中腸、后腸Na+，K+-ATP酶和γ-GT以及前腸、中腸、后腸AKP活力(P＜0.05)，但二者對前腸Na+，K+-ATP酶和γ-GT活力的影響差異不顯著(P＞0.05)。

表7 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉腸道刷狀緣酶活力的影響Table 7 Comparison of effects of crystalline tryptophane and coated tryptophane on brush border enzyme activities in intestine of juvenile Jian carp U/g

2.4 晶體色氨酸和包膜色氨酸的體外釋放速率

由表8可知，晶體色氨酸在15 min內(nèi)就釋放完全，而包膜色氨酸在15 min時(shí)僅釋放了不到11%，但120 min后2種形式的色氨酸體外釋放速率差異不顯著(P＞0.05)。

表8 晶體色氨酸和包膜色氨酸的體外釋放速率Table 8 Release rate of crystalline tryptophane and coated tryptophan in vitro %

3 討論

3.1 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉生長性能影響的比較

從本試驗(yàn)結(jié)果可知，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的特定生長率。有研究表明，與晶體賴氨酸相比，包被處理的賴氨酸促進(jìn)了幼建鯉生長［22］;微囊(包膜的一種形式)蘇氨酸與晶體蘇氨酸相比能顯著提高幼建鯉的增重［23］;與晶體氨基酸相比，包被處理的氨基酸能顯著提高日本對蝦的生長［24］。同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的飼料利用率、蛋白質(zhì)沉積率和脂肪沉積率。這與本課題組在不同形式的賴氨酸［22］、蘇氨酸［23］和蛋氨酸［25］對幼建鯉生長性能影響的研究上所得結(jié)果一致。飼料利用率的提高和營養(yǎng)物質(zhì)沉積的增加可能與包膜色氨酸促進(jìn)了幼建鯉腸道的生長發(fā)育以及提高腸道皺襞、增加腸道的吸收面積有關(guān)。因此，包膜色氨酸與晶體色氨酸相比能更有效地促進(jìn)幼建鯉的生長，提高其飼料利用率和蛋白質(zhì)、脂肪的沉積。

3.2 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉蛋白質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)影響的比較

氨氮是魚類蛋白質(zhì)代謝的最主要的代謝廢物［23］。在本試驗(yàn)中，包膜色氨酸組血漿氨濃度顯著低于晶體色氨酸組，說明包膜色氨酸可能較晶體色氨酸更有利于體氮沉積。這與本課題組對晶體形式和包膜形式的賴氨酸［22］、蘇氨酸［23］和蛋氨酸［25］影響幼建鯉血氨濃度的比較上的結(jié)果一致。這可能與晶體氨基酸和包膜氨基酸在體內(nèi)與其他氨基酸的吸收同步性不同有關(guān)。本試驗(yàn)對晶體色氨酸和包膜色氨酸的體外釋放速率的測定結(jié)果表明:晶體色氨酸在15 min內(nèi)完全釋放，而包膜色氨酸則需要180 min才能完全釋放，說明包膜色氨酸對氮沉積的促進(jìn)效果優(yōu)于晶體氨基酸可能是由于其在體內(nèi)釋放速率較慢，能更有效地與其他氨基酸的吸收保持同步性，從而有利于蛋白質(zhì)的合成。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)包膜形式的賴氨酸［22］、蘇氨酸［23］和蛋氨酸［25］在體外的釋放速率也顯著低于其晶體形式，與本研究結(jié)果一致。GOT和GPT是蛋白質(zhì)代謝中最重要的2種酶，其活力的大小能反映動(dòng)物體氨基酸代謝強(qiáng)度的大小［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比較，包膜色氨酸顯著降低了幼建鯉肝胰臟和肌肉中GOT和GPT活力，雖然到目前為止未見不同形式色氨酸對魚類肝臟或肝胰臟和肌肉中轉(zhuǎn)氨酶活力影響的研究，但該結(jié)果與晶體蘇氨酸和包膜蘇氨酸對幼建鯉肝胰臟和肌肉中轉(zhuǎn)氨酶活力的影響變化趨勢一致［23］，推測其可能的原因?yàn)榫w色氨酸在動(dòng)物體內(nèi)與其他氨基酸吸收不同步，導(dǎo)致大量的晶體氨基酸用于分解代謝供能，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 晶體色氨酸和包膜色氨酸對幼建鯉消化吸收能力影響的比較

腸道是魚類消化吸收的主要場所，腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力能直接反映其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力［27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉腸道胰蛋白酶、脂肪酶活力，說明包膜色氨酸能更有效地提高幼建鯉對蛋白質(zhì)和脂肪的消化能力。消化能力的提高可能與其能更有效地促進(jìn)幼建鯉消化器官的生長發(fā)育有關(guān)。腸道和胰腺是魚類最主要的消化器官。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉腸道和肝胰臟的蛋白質(zhì)含量，腸長指數(shù)、腸體指數(shù)及肝體指數(shù)也顯著增加，說明包膜色氨酸能更有效地促進(jìn)腸道和肝胰臟的生長發(fā)育。胰腺是魚類分泌蛋白酶和脂肪酶的主要場所，胰腺中消化酶活力的大小能反映其分泌消化酶的能力［27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉肝胰臟胰蛋白酶和脂肪酶活力，說明包膜色氨酸能更有效地提高幼建鯉分泌消化酶的能力，這也是包膜色氨酸比晶體色氨酸能更有效地提高幼建鯉消化蛋白質(zhì)和脂肪能力的可能原因之一。

腸道同時(shí)也是魚類，特別是無胃魚類吸收的主要場所［7］。腸道刷狀緣酶 Na+，K+-ATP酶、AKP、γ-GT活力能有效反映魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力［27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉中腸和后腸Na+，K+-ATP酶、γ-GT活力，顯著提高了其前腸、中腸和后腸AKP活力。本課題組前期的研究結(jié)果表明，幼建鯉中腸、后腸刷狀緣酶活力顯著高于其前腸，幼建鯉吸收營養(yǎng)物質(zhì)的最主要場所是中腸和后腸［10-12］。上述結(jié)果說明包膜色氨酸能更有效地提高幼建鯉的吸收功能。腸道皺襞高度能反映魚類腸道的吸收面積［27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸顯著提高了幼建鯉的腸道皺襞高度，從而有效增加了其腸道的吸收面積，為提高其吸收能力奠定了基礎(chǔ)。因此，包膜色氨酸較晶體色氨酸可更有效地促進(jìn)幼建鯉肝胰臟和腸道的生長發(fā)育，增加腸道的吸收面積，從而提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力。

4 結(jié)論

①與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸能更有效地提高幼建鯉的生長性能。

②與晶體色氨酸相比，包膜色氨酸釋放速率較低，能與體內(nèi)其他氨基酸的吸收速率保持較好的同步性，能更有效地提高幼建鯉的消化吸收能力，有利于其體蛋白質(zhì)的合成。

［1］NOSE T.Summary report on the requirements of essential amino acids for carp［M］//TIEWS K，HALVER J E.Finfish nutrition and fishfeed technology.Berlin:OAI，1979:145-156.

［2］COSOSO R M，TIRO L B，BENITEZ L V.Requirement for tryptophan by milkfish(Chanos chanos Forsskal)juveniles［J］.Fish Physiology and Biochemistry，1992，10(1):35-41.

［3］涂永鋒，葉元土，宋代軍，等.游離異亮氨酸對鯽魚的促生長作用［J］.飼料工業(yè)，2004，25(8):52-55.

［4］王冠，冷向軍，李小勤，等.飼料中添加包膜氨基酸對異育銀鯽生長和體成分的影響［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15(3):365-369.

［5］BOGUT I，ADAMKOVA I，RASTIJA T，et al.Effect of additive lysine to fodder on the growth of carp fry(Cyprinus carpio)and protein conservation［J］.Krmiva，2000，42(2):59-64.

［6］AOKI H，AKIMOTO A，WATANABE T.Periodical changes of plasma free amino acid levels and feed digesta in yellowtail after feeding non-fishmeal diets with or without supplemental crystalline amino acids［J］.Fisheries Science，2001，67(4):614-618.

［7］李愛杰.水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

［8］TESHIMA S，KANAZAWA A，YAMASHITA M.Dietary value of several proteins and supplemental amino acids for larvae of the prawn Penaeus japonicus［J］.Aquaculture，1986，51(3/4):225-235.

［9］WILSON R P，ALLEN O W，Jr，ROBINSON E H，et al.Tryptophan and threonine requirements of fingerling channel catfish［J］.The Journal of Nutrition，1978，108(10):1595-1599.

［10］HE W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Dietary pyridoxine requirement of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15(4):402-408.

［11］WEN Z P，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Effect of dietary pantothenic acid supplement on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15(5):470-476.

［12］JIANG W D，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Growth，digestive capacity and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary inositol［J］.Aquaculture Research，2009，40(8):955-962.

［13］LI W，ZHOU X Q，F(xiàn)ENG L，et al.Effect of dietary riboflavin on growth，feed utilization，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16(2):137-143.

［14］AOAC.Official methods of analysis of AOAC international［S］.16th ed.Gaithersburg，MD:AOAC International，1998.

［15］LIN Y，ZHOU X Q.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture，2006，256(1/2/3/4):389-394.

［16］HUMMEL B C W.A modified spectrophotometric determination of chymotrypsin，trypsin，and thrombin［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，1959，37:1393-1399.

［17］FURNé M，HIDALGO M C，LóPEA A，et al.Digestive enzyme activities in Adriatic sturgeon Acipenser naccarii and rainbow trout Oncorhynchus mykiss.A comparative study［J］.Aquaculture，2005，250(1/2):391-398.

［18］BESSEY O A，LOWRY O H，BROCK M J.Rapid coloric method for determination of alkaline phosphatase in five cubic millimeters of serum［J］.Journal of Biological Chemistry，1946，164:321-329.

［19］ROSALKI S B，RAU D，LEHMANN D，et al.Determination of serum gamma-glutamyl transpeptidase activity and its clinical applications［J］.Annals of Clinical Biochemistry，1970，7:143-147.

［20］MCCORMIA S D.Methods for nonlethal gill biopsy and measurement of Na+，K+-ATPase［J］.Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，1993，50(3):656-658.

［21］LóPEZ-ALVARADO J，LANGDON C J，TESHIMA S I，et al.Effects of coating and encapsulation of crystalline amino acids on leaching in larval feeds［J］.Aquaculture，1994，122(4):335-346.

［22］ZHOU X Q，ZHAO C R，LIN Y.Compare the effect of diet supplementation with uncoated or coated lysine on juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2007，13(6):457-461.

［23］馮琳，彭艷，劉楊，等.晶體蘇氨酸和微囊蘇氨酸對幼建鯉生長性能和消化吸收能力影響的比較研究［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(5):771-780.

［24］ALAM M S，TESHIMA S，KOSHIO S，et al.Effects of supplementation of coated crystalline amino acids on growth performance and body composition of juvenile kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus［J］.Aquaculture Nutrition，2004，10(5):309-316.

［25］帥柯.蛋氨酸對幼建鯉消化功能和免疫功能的影響［D］.碩士學(xué)位論文.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［26］BERGE G E，SVEIER H，LIED E.Nutrition of Atlantic salmon(Salmo salar):the requirement and metabolic effect of lysine［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular＆Integrative Physiology，1998，120(3):477-485.

［27］TANG L，WANG G H，ZHOU X Q，et al.Effect of methionine on intestinal enzymes activities，microflora and humoral immune of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15(5):477-480.