梁闊+劉爽+崔葉青+孫海晨+羅斌+萬歲桂+孫雪靜+李非

[摘要] 目的 探討雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，Tri）在小鼠同種異體皮膚移植中的免疫抑制作用及其可能的作用機制。 方法 采用BALB/c小鼠作為供體，C57BL/6小鼠作為受體，建立皮膚移植模型。隨機分為3組，每組8只。移植術后前6天（0～5 d）分別予腹腔注射1%吐溫80溶劑（對照組）、Tri 100 μg/kg（L-Tri組）和Tri 200 μg/kg（H-Tri組）。術后觀察移植皮片存活情況。并于術后第7天每組隨機選取3只，切取脾臟以流式細胞術檢測脾淋巴細胞中CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞比例。 結果 對照組、L-Tri組和H-Tri組移植皮片平均存活時間分別為（8.3±1.2）、（12.4±1.9）、（14.9±2.2）d；脾淋巴細胞中CD4+ CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞比例分別為（5.6±0.8）%、（12.6±1.5）%和（16.1±2.1）%；L-Tri組及H-Tri組與對照組比較，H-Tri組與L-Tri組比較，小鼠移植皮膚平均存活時間均明顯延長（P < 0.05），CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞數(shù)量也明顯增加（P < 0.05）。 結論 Tri能夠抑制移植后排斥反應，延長小鼠同種異體皮膚移植的存活時間，其免疫作用機制可能與上調(diào)移植受體CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞的比例有關，并且其免疫抑制作用具有一定的劑量依賴性。

[關鍵詞] 皮膚移植；免疫抑制；雷公藤內(nèi)酯醇；作用機制

[中圖分類號] R657.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0012-04

Immunosuppressive effect and mechanism of Triptolide on skin allografts in mice

LIANG Kuo1 LIU Shuang1 CUI Yeqing1 SUN Haichen1 LUO Bin1 WAN Suigui2 SUN Xuejing2 LI Fei1▲

1.Department of General Surgery， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China； 2.Department of Hematology， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China

[Abstract] Objective To investigate the immunosuppressive effect and the possible mechanism of Triptolide on skin allografts in murine model. Methods BALB/c mice to C57BL/6 mice skin allografting models were created. The recipients were divided into three groups. The mice in the treatment groups were injected intraperitoneally with Triptolide at 100 μg/kg （low-dose Triptolide group， L-Tri group） or 200 μg/kg （high-dose Triptolide group， H-Tri group） daily in the first 6 days （0-5 days）； while the mice in control group were given vehicles （1% Tween 80）. The median survival time of skin allografts in each group was monitored. The proportion of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissue were tested by flow cytometry. Results The median survival time of skin allografts in the control group， L-Tri group and H-Tri group were （8.3±1.2）， （12.4±1.9） d and （14.9±2.2） d respectively. The percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissues of three groups were （5.6±0.8） %， （12.6±1.5）% and （16.1±2.1）% respectively. Compared with control group， the L-Tri group and H-Tri group show significantly prolonged skin allograft survival time （P < 0.05）， increased percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells （P < 0.05）. Conclusion Tri can inhibit immune rejection， prolong the skin allograft survival time in mice. The anti-rejection effect of Tri may be attributed to the upregulation of regulatory T cells. In addition， the immunosuppressive effect of triptolide shows dose-dependent.endprint

[Key words] Skin transplantation； Immunosuppression； Triptolide； Mechanism

同種器官移植已成為治療人類腎臟、心臟及肝臟等嚴重疾病的一種重要手段。但是，由于目前臨床應用的免疫抑制劑長期使用時具有一定的毒副作用，因此研制開發(fā)新型、高效、低毒的免疫抑制劑，一直是臨床關注的熱點[1-2]。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，Tri）是從我國傳統(tǒng)中藥雷公藤中分離出來的含有三個環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯化合物，具有較強的抗炎、抗腫瘤和免疫抑制作用[3-4]。動物實驗證實其在心臟[5-6]、腎臟[7]、肝臟[8]、肺臟[9]、胰島[10-11]等多種移植模型中均具有較好的抗排斥作用，是一種極有潛力的免疫抑制藥物。但目前國內(nèi)外學者對于Tri在移植中的抗排斥作用機制仍然存在較多爭論[12]。本研究旨在通過觀察Tri在小鼠同種異體皮膚移植中的抗排斥效果，初步探討其可能的免疫作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

近交系雄性BALB/c小鼠（H-2d）8只為供體，雄性C57BL/6（H-2b）24只為受體，均為8～12周齡，體重22～25 g，購自北京維通利華公司。飼養(yǎng)于恒溫（25～27℃）、恒定濕度（45%～55%）、無特定病原體（SPF級）環(huán)境中。

1.2 主要試劑

Tri購自中國藥品生物制品檢定所，吐溫80購自北京思語偉業(yè)生物公司，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、膠原酶Ⅴ購自Sigma公司，F(xiàn)icoll 400購自瑞典Pharmacia公司，胎牛血清購自Gibco公司，免疫組化試劑購自邁新公司。藻紅蛋白（PE）標記的抗小鼠Foxp3單克隆抗體（mAb）、異硫氰酸熒光素（ FITC）標記的抗小鼠CD4單克隆抗體（mAb）、別藻青蛋白（APC）標記的抗小鼠CD25單克隆抗體（mAb）等免疫熒光染料均購自eBioscience公司。

1.3 皮膚移植與分組

供體（BALB/c）脫椎法處死后，取尾部皮膚，剪成0.8 cm×0.8 cm大小的皮片置于無菌PBS中備用。C57BL/6受鼠給予4%水合氯醛腹腔注射（10 μL/g）麻醉。制備受鼠背部移植床，將供體皮片置于移植床，6-0絲線縫合固定，皮片表面敷蓋凡士林油紗并用無菌紗布包扎覆蓋，創(chuàng)可貼包扎固定，單籠飼養(yǎng)。3 d后去掉凡士林油紗和無菌紗布，逐日觀察移植物排斥狀況。以皮片結痂、變硬、壞死、縮小到初始測量尺寸的50%時，定義為移植皮膚被排斥標準[13]。術后分成對照組和治療組[包括L-Tri組（100 μg/kg）和H-Tri組（200 μg/kg）]。治療組術后連續(xù)6 d腹腔注射Tri，對照組給予等體積溶劑（1%吐溫80）。

1.4 流式細胞術

移植術后第7天，分別制備各組小鼠的脾淋巴細胞懸液，將濃度調(diào)制5×106/mL。然后取1 mL細胞懸液加入FITC-抗CD4單抗（0.25 μg/106個細胞）和APC-抗CD25單抗（0.125 μg/106個細胞），室溫共孵育15 min，F(xiàn)oxp3-PE標記參照試劑盒操作指南進行破膜標記。標記后的細胞用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次。1%多聚甲醛300 μL重懸固定，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，取400 μL上FACScan流式細胞儀進行分析。每份標本均設同型對照，取2次檢測結果均值進行統(tǒng)計學處理。以流式細胞儀雙色、三色分析法分別分析CD4+ CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的比例。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Tri對移植皮膚存活時間的影響

對照組移植皮膚平均存活時間為（8.3±1.2）d，L-Tri組為（12.4±1.9）d，H-Tri組為（14.9±2.2）d；與對照組相比，L-Tri組和H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）；與L-Tri組相比，H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

A B

A：三組移植皮膚的生存曲線；B：三組移植皮膚的平均生存時間，*P < 0.05，**P < 0.01

圖1 Tri對小鼠同種異體移植皮膚生存時間的影響

2.2 流式細胞檢測結果

皮膚移植術后第7天，Tri處理組脾細胞CD4+ CD25+ Foxp3+ T reg的比例明顯增加，H-Tri組為（16.1±2.1）%，明顯高于L-Tri組[（12.6±1.5）%]（P=0.00），且兩組均明顯高于對照組[（5.6±0.8）%]（P=0.01）。見圖2。

3 討論

器官移植已經(jīng)成為治療終末期器官衰竭的最有效手段，但移植術后的免疫排斥反應卻長期影響著移植效果和患者的生存質(zhì)量，免疫抑制藥物的合理應用是移植成敗的關鍵。目前常用的免疫抑制劑的作用效果仍不十分理想，長期應用可造成肝、腎功能受損、感染風險增加、腫瘤發(fā)生率增加等一系列不良反應。因此，研究開發(fā)新型、低毒、高效的抗排斥藥物，探索更為有效的免疫抑制方案仍然是當前迫切需要解決的問題[6]。

近幾年的研究顯示，Tri在體內(nèi)、體外均具有較好的免疫抑制活性[14]，在器官移植領域有一定應用前景。在大鼠同種異體心臟移植模型中，Tri能夠明顯延長移植心臟的存活時間，并與他克莫司和環(huán)孢霉素均具有明顯協(xié)同作用[5]。在小鼠同種異體心臟移植研究中，Tri能夠延長移植心臟存活時間，并與雷帕霉素顯示出了良好的協(xié)同作用[6]。有學者研究顯示，在大鼠同種異體腎臟移植中，Tri同樣能夠明顯延長移植腎臟的存活時間[7]。鄭樹森等[8]研究證實，雷公藤多苷能夠輕度抑制大鼠異種原位肝移植排斥反應。He等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Tri能夠減輕移植肺臟的缺血再灌注損傷，改善移植肺功能。本研究將Tri應用于小鼠同種異體皮膚移植模型，觀察到Tri能夠抑制其免疫排斥反應，有效延長移植物的存活時間，并且隨著Tri劑量的增加，其免疫抑制作用也明顯增強，提示Tri的抗排斥作用與藥物劑量有一定相關性。但Tri發(fā)揮免疫抑制作用的機制尚未完全闡明，國內(nèi)外學者仍然存在較多的爭論。endprint

近年來研究顯示，作為一種新的免疫抑制劑，Tri可抑制T細胞增殖，誘導T細胞和樹突狀細胞（DC）的凋亡，抑制抗原遞呈細胞的抗原遞呈，抑制DC表達主要組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類分子[15]，抑制IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生[16]。CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是Sakaguchi 等于1995 年首先發(fā)現(xiàn)，存在于外周血及脾臟組織的CD4+ T細胞中的一類具有獨特抑制功能的T細胞亞群。在小鼠體內(nèi)占CD4+ T細胞的5%～10%，而在人體內(nèi)只占2%～3%。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞作為一群具有免疫負調(diào)控功能的T細胞亞群，通過抑制其他免疫效應細胞的激活和增殖，對抑制移植排斥反應和誘導移植免疫耐受起重要作用[17-18]，而輸注CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞可以促進移植物存活[19]。在同種移植中，有研究證實，CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對于預防或糾正慢性移植物抗宿主反應（GVHD）有重要作用[20]。許多研究表明，CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞亦可以影響巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、B細胞等的功能[6，21]。Foxp3（forkhead/winged helix transciption factor）作為叉頭狀轉錄因子，為CD4+CD25+ T細胞的發(fā)育和功能所必需[22]。Tri能夠促進Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生[23-24]。

本實驗結果顯示，給予皮膚移植小鼠應用不同劑量Tri，能夠提高受體小鼠脾臟CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞的數(shù)量，延長移植皮膚的存活時間，并具有一定劑量依賴效應。由此推斷，Tri可能通過增加移植受體CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞的數(shù)量，誘導免疫耐受，從而發(fā)揮延長移植物存活時間的作用。但Tri誘導CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞上調(diào)的分子機制目前尚不清楚，還需進一步研究。

[參考文獻]

[1] Hardinger KL，Brennan DC. Novel immunosuppressive agents in kidney transplantation [J]. World J Transplant，2013，3（4）：68-77.

[2] Silva HT Jr，F(xiàn)elipe CR，Garcia VD，et al. Planned randomized conversion from tacrolimus to sirolimus-based immunosuppressive regimen in de novo kidney transplant recipients [J]. Am J Transplant，2013，13（12）：3155-3163.

[3] 任曉榮，樊紅翠，尉杰忠，等.雷公藤內(nèi)酯醇對EAE小鼠脊髓IL-10、IFN-γ表達的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2010， 7（15）：18-20.

[4] 張劍宇，彭嵐，劉定華.雷公藤對重癥肌無力外周血T淋巴細胞亞群的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2008，5（6）：80-81.

[5] Li R，Takazawa K，Suzuki H，et al. Synergistic effect of triptolide and tacrolimus on rat cardiac allotransplantation [J]. Jpn Heart J，2004，45（4）：657-665.

[6] Liu Y，Chen Y，Liu FQ，et al. Combined treatment with triptolide and rapamycin prolongs graft survival in a mouse model of cardiac transplantation [J]. Transpl Int，2008，21（5）：483-494.

[7] Zhang G，Chen J，Liu Y，et al.Triptolide-conditioned dendritic cells induce allospecific T-cell regulation and prolong renal graft survival [J]. J Invest Surg，2013，26（4）：191-199.

[8] 鄭樹森，郭華，俞軍，等.雷公藤多甙抑制大鼠異種肝移植急性排斥的研究[J].中華器官移植雜志，2003，24（6）：223-225.

[9] He JK，Yu SD，Zhu HJ，et al. Triptolide inhibits NF-kappaB activation and reduces injury of donor lung induced by ischemia/reperfusion [J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28（12）：1919-1923.

[10] Huang SH，Lin GJ，Chu CH，et al. Triptolide ameliorates autoimmune diabetes and prolongs islet graft survival in nonobese diabetic mice [J]. Pancreas，2013，42（3）：442-451.

[11] Xin MJ，Cui SH，Liu S，et al. Triptolide prolonged allogeneic islet graft survival in chemically induced and spontaneously diabetic mice without impairment of islet function [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9（3）：312-318.endprint

[12] Wang Y，Jia L，Wu CY. Triptolide inhibits the diferentiation of Th17 cells and suppresses collagen-induced arthritis[J]. Scand J Immunol，2008，68（4）：383-390.

[13] 張進生，管德林，許建軍，等.1，25-（OH）2D3對小鼠皮膚移植后脾T細胞亞群、MLR及NK細胞活性的影響[J].中華器官移植雜志，2003，24（4）：226-229.

[14] Han R，Rostami-Yazdi M，Gerdes S，et al. Triptolide in the treatment of psoriasis and other immune-mediated inflammatory diseases [J]. Br J Clin Pharmacol，2012，74：424-436.

[15] Zhu K，Shen Q，Chang H，et al. Triptolide affects the differentiation，maturation and function of human dendritic cells [J]. Int Immunopharmaco1，2005，5（9）：1415-1426.

[16] Liu Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions [J]. Int Immunopharmacol，2011，11（3）：377-383.

[17] Oliver K，Lisa M，Ebert，et al. Flt3 ligand expands CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human subjects [J]. European Journal of Immunology，2013，43（2）：533-539.

[18] Jiang X，Sun W，Guo D，et al. Cardiac allograft acceptance induced by blockade of CD40-CD40L costimulation is dependent on CD4（+）CD25（+）regulatory T cells [J]. Surgery，2011，149（3）：336-346.

[19] Joffre O，Santolaria T，Calise D，et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T lymphocytes [J]. Nat Med，2008，14（1）：88-92.

[20] Piotr T，Anna DM，Maria B，et al. Treatment of Graft-versus-Host Disease with Naturally Occurring T Regulatory Cells [J]. BioDrugs，2013，27（6）：605-614.

[21] Trzonkowski P，Szarynska M，Mysliwska J，et al. Ex vivo expansion of CD4（+）CD25（+）T regulatory cells for immune-suppressive therapy [J]. Cytometry，2009，75（3）：175-188.

[22] Hori S，Nomura T，Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FoxP3 [J]. Science，2003，299：1057-1061.

[23] Zhang G，Liu Y，Guo H，et al. Triptolide promotes generation of FoxP3+ T regulatory cells in rats [J]. J Ethnophar macol，2009，125（1）：41-46.

[24] Li G，Ren J，Wang G，et al. T2 enhances in situ level of Foxp3（+） regulatory cells and modulates inflammatory cytokines in Crohn's disease [J]. Int Immunopharmacol，2014， 18（2）：244-248.

（收稿日期：2014-04-08 本文編輯：程 銘）endprint

[12] Wang Y，Jia L，Wu CY. Triptolide inhibits the diferentiation of Th17 cells and suppresses collagen-induced arthritis[J]. Scand J Immunol，2008，68（4）：383-390.

[13] 張進生，管德林，許建軍，等.1，25-（OH）2D3對小鼠皮膚移植后脾T細胞亞群、MLR及NK細胞活性的影響[J].中華器官移植雜志，2003，24（4）：226-229.

[14] Han R，Rostami-Yazdi M，Gerdes S，et al. Triptolide in the treatment of psoriasis and other immune-mediated inflammatory diseases [J]. Br J Clin Pharmacol，2012，74：424-436.

[15] Zhu K，Shen Q，Chang H，et al. Triptolide affects the differentiation，maturation and function of human dendritic cells [J]. Int Immunopharmaco1，2005，5（9）：1415-1426.

[16] Liu Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions [J]. Int Immunopharmacol，2011，11（3）：377-383.

[17] Oliver K，Lisa M，Ebert，et al. Flt3 ligand expands CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human subjects [J]. European Journal of Immunology，2013，43（2）：533-539.

[18] Jiang X，Sun W，Guo D，et al. Cardiac allograft acceptance induced by blockade of CD40-CD40L costimulation is dependent on CD4（+）CD25（+）regulatory T cells [J]. Surgery，2011，149（3）：336-346.

[19] Joffre O，Santolaria T，Calise D，et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T lymphocytes [J]. Nat Med，2008，14（1）：88-92.

[20] Piotr T，Anna DM，Maria B，et al. Treatment of Graft-versus-Host Disease with Naturally Occurring T Regulatory Cells [J]. BioDrugs，2013，27（6）：605-614.

[21] Trzonkowski P，Szarynska M，Mysliwska J，et al. Ex vivo expansion of CD4（+）CD25（+）T regulatory cells for immune-suppressive therapy [J]. Cytometry，2009，75（3）：175-188.

[22] Hori S，Nomura T，Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FoxP3 [J]. Science，2003，299：1057-1061.

[23] Zhang G，Liu Y，Guo H，et al. Triptolide promotes generation of FoxP3+ T regulatory cells in rats [J]. J Ethnophar macol，2009，125（1）：41-46.

[24] Li G，Ren J，Wang G，et al. T2 enhances in situ level of Foxp3（+） regulatory cells and modulates inflammatory cytokines in Crohn's disease [J]. Int Immunopharmacol，2014， 18（2）：244-248.

（收稿日期：2014-04-08 本文編輯：程 銘）endprint

[12] Wang Y，Jia L，Wu CY. Triptolide inhibits the diferentiation of Th17 cells and suppresses collagen-induced arthritis[J]. Scand J Immunol，2008，68（4）：383-390.

[13] 張進生，管德林，許建軍，等.1，25-（OH）2D3對小鼠皮膚移植后脾T細胞亞群、MLR及NK細胞活性的影響[J].中華器官移植雜志，2003，24（4）：226-229.

[14] Han R，Rostami-Yazdi M，Gerdes S，et al. Triptolide in the treatment of psoriasis and other immune-mediated inflammatory diseases [J]. Br J Clin Pharmacol，2012，74：424-436.

[15] Zhu K，Shen Q，Chang H，et al. Triptolide affects the differentiation，maturation and function of human dendritic cells [J]. Int Immunopharmaco1，2005，5（9）：1415-1426.

[16] Liu Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions [J]. Int Immunopharmacol，2011，11（3）：377-383.

[17] Oliver K，Lisa M，Ebert，et al. Flt3 ligand expands CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human subjects [J]. European Journal of Immunology，2013，43（2）：533-539.

[18] Jiang X，Sun W，Guo D，et al. Cardiac allograft acceptance induced by blockade of CD40-CD40L costimulation is dependent on CD4（+）CD25（+）regulatory T cells [J]. Surgery，2011，149（3）：336-346.

[19] Joffre O，Santolaria T，Calise D，et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T lymphocytes [J]. Nat Med，2008，14（1）：88-92.

[20] Piotr T，Anna DM，Maria B，et al. Treatment of Graft-versus-Host Disease with Naturally Occurring T Regulatory Cells [J]. BioDrugs，2013，27（6）：605-614.

[21] Trzonkowski P，Szarynska M，Mysliwska J，et al. Ex vivo expansion of CD4（+）CD25（+）T regulatory cells for immune-suppressive therapy [J]. Cytometry，2009，75（3）：175-188.

[22] Hori S，Nomura T，Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor FoxP3 [J]. Science，2003，299：1057-1061.

[23] Zhang G，Liu Y，Guo H，et al. Triptolide promotes generation of FoxP3+ T regulatory cells in rats [J]. J Ethnophar macol，2009，125（1）：41-46.

[24] Li G，Ren J，Wang G，et al. T2 enhances in situ level of Foxp3（+） regulatory cells and modulates inflammatory cytokines in Crohn's disease [J]. Int Immunopharmacol，2014， 18（2）：244-248.

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