黃清松，李紅枝，鄭 敏，陳愛(ài)葵

（1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510006；2.廣東教育學(xué)院生物系，廣東 廣州 510303）

姬松茸（Agaricus Blazei Murill）為蘑菇科蘑菇屬真菌，富含蛋白質(zhì)和糖類。姬松茸多糖是從姬松茸子實(shí)體中提取的有效活性成分，具有螺旋狀的三維立體結(jié)構(gòu)，是一種β型的葡聚糖。據(jù)相關(guān)研究[1－3]報(bào)道：姬松茸多糖具有降血糖、提高免疫力、抗病毒和抗腫瘤等作用。關(guān)于姬松茸多糖提高腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及其機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。D-半乳糖（D-gal）致動(dòng)物衰老模型由徐黻本首次提出，在國(guó)內(nèi)已被廣泛應(yīng)用。許多學(xué)者在大鼠和小鼠上都證實(shí)該模型表現(xiàn)出幾種與人類自然衰老相類似的機(jī)能改變，包括出現(xiàn)腦老化[4－6]。本研究以頸背部皮下注射D－gal制備腦老化小鼠模型，采用水迷宮、避暗儀、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，觀察姬松茸粗多糖對(duì)D－gal致腦老化模型小鼠行為學(xué)、海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡的影響，探討其提高腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及可能機(jī)制，為更好地開發(fā)利用姬松茸資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 雄性昆明種小鼠40只，體質(zhì)量20～25g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 藥品制備 姬松茸粗多糖由本研究組自制：取姬松茸原菌體1 000g，加約5倍蒸餾水浸泡12h，文火煮沸1h，收集煎液，再加等體積的蒸餾水文火煮沸30min，收集煎液。合并2次煎液，靜置12h，過(guò)濾，濃縮至一定體積后，加入80%的乙醇沉淀12h，離心，收集醇沉物。醇沉物于恒溫干燥箱（75℃～80℃）至相對(duì)干燥，獲得姬松茸多糖粗制品，每克浸膏相當(dāng)于生藥3.0g。

1.3 主要試劑與儀器 Annexin V-FITC ＆PI試劑盒為美國(guó)Pharmingen公司產(chǎn)品，JC-1試劑盒為美國(guó)Cell Technology（細(xì)胞工程）公司產(chǎn)品；Morris水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，型號(hào)：DMS-2），小鼠避暗儀（成都泰盟公司，型號(hào)：BA-200），流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)：FC 500）。

1.4 動(dòng)物模型制備與分組 小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常組，D-gal腦老化模型組，姬松茸粗多糖低、高劑量組。除正常組小鼠頸背部皮下注射生理鹽水外，其他各組小鼠頸背部皮下注射D-gal 120mg·kg－1，每天1次，連續(xù)42d，制備小鼠亞衰老模型。在制備動(dòng)物模型的同時(shí)，正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，姬松茸粗多糖低、高劑量組小鼠分別灌胃姬松茸粗多糖60和120mg·kg－1，每天1次。42d后進(jìn)行行為學(xué)、海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡的檢測(cè)。行為學(xué)檢測(cè)期間正常飼養(yǎng)小鼠。

1.5 空間探索測(cè)試[7]測(cè)試設(shè)備為 Morris水迷宮。迷宮水池壁上標(biāo)明4個(gè)等距離點(diǎn)，等分成4個(gè)象限。在位于池壁和圓心中間的第4象限放置一平臺(tái)，平臺(tái)沒(méi)于水下1cm，水中倒入牛奶，使小鼠視覺(jué)無(wú)法辨別平臺(tái)。設(shè)定平臺(tái)為中心，中心區(qū)域?yàn)榘霃?cm環(huán)內(nèi)，中環(huán)為向外25cm內(nèi)，外環(huán)為再向外40cm。通過(guò)迷宮上方與計(jì)算機(jī)相連接攝像機(jī)全程跟蹤小鼠活動(dòng)軌跡。實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境進(jìn)行，水池水溫（25.0±1.0）℃。正式測(cè)試前先對(duì)各組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練：從水迷宮池壁第2象限（遠(yuǎn)離目標(biāo)象限）處放下小鼠，記錄小鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間。如果小鼠在3min內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)，待小鼠爬上平臺(tái)并停留20s。每天訓(xùn)練1次，連續(xù)5d。第6天撤去平臺(tái)，隨機(jī)選下水點(diǎn)進(jìn)行正式測(cè)試，以3min內(nèi)小鼠分別在中心區(qū)、中環(huán)、外環(huán)的游泳距離占總距離的百分比及第4象限（目標(biāo)象限）游泳路程表示小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.6 被動(dòng)回避測(cè)試 避暗儀由明暗兩室組成，大小相同，底部為不銹鋼柵。明室上方裝置15W日光燈一只，暗室通36V電壓。首先進(jìn)行記憶獲得性訓(xùn)練：將小鼠放入明室，因天生具有嗜暗習(xí)性，小鼠鉆入暗箱即遭受電擊，迅速逃離暗室，從而獲得暗箱遭受電擊記憶，為期1d。24h后，將小鼠放入明室，記錄300s內(nèi)小鼠放入明室到進(jìn)入暗室的時(shí)間（潛伏期）和進(jìn)入暗室的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），以此表示小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.7 海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位測(cè)定 小鼠頸椎脫臼處死，迅速取出全腦，冰盤上分離海馬，投入液氮冷凍后取出，放入冰箱（－80℃）保存?zhèn)溆谩z測(cè)時(shí)，海馬置于盛生理鹽水的培養(yǎng)皿，用2張?zhí)幚頋崈舻妮d玻片輕研組織至勻漿狀，過(guò)300目篩網(wǎng)制備成單細(xì)胞懸液，懸液于室溫下5 000r·min－1離心2min，棄上清，加入10mg·L－1的JC-1，避光靜置15min后，以激發(fā)波長(zhǎng)488nm行流式細(xì)胞分析。采用Cell Quest數(shù)據(jù)處理軟件，獲取1×104個(gè)細(xì)胞。以測(cè)量JC-1的熒光強(qiáng)度（反映線粒體膜電位的高低）來(lái)了解小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的變化。

1.8 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 制備單細(xì)胞懸液（方法同1.7），冰預(yù)PBS洗細(xì)胞2次，以1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106mL－1，取細(xì)胞懸液100μL至5mL管，再加入Annexin-V-FITC 5μL、PI 10μL，混勻。于避光室溫下孵育15min，然后每管加入1×結(jié)合緩沖液400μL，1h內(nèi)激發(fā)波長(zhǎng)488nm行流式細(xì)胞分析。計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，所有資料均經(jīng)Cell Qust軟件收集處理，以細(xì)胞凋亡百分率表示小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 14.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組小鼠空間探索測(cè)試指標(biāo)、潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡百分率以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠空間探索測(cè)試結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠在外環(huán)區(qū)域的游泳距離占總游泳距離百分比顯著增多（P＜0.01），中環(huán)和中心區(qū)域的游泳距離占總游泳距離百分比顯著減少（P＜0.01），第4象限游泳路程顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，姬松茸粗多糖組小鼠中心區(qū)域游泳距離占其總距離百分比明顯提高（P＜0.05或P＜0.01），第4象限游泳路程明顯增多（P＜0.05）。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠空間探索測(cè)試指標(biāo)Tab.1 Experimental indicators of space exploration of mice in vanous groups （n＝10，±s）

表1 各組小鼠空間探索測(cè)試指標(biāo)Tab.1 Experimental indicators of space exploration of mice in vanous groups （n＝10，±s）

＊ P＜0.01compared with normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group Dosage（mg·kg－1）Outer ring（η/%）Middle ring（η/%） Centre（η/%） Swimming course（l/cm）Normal — 52.47±7.26 42.51±7.15 5.82±1.46 317.25±85.62 Model — 63.75±9.34＊ 34.15±6.32＊ 2.64±1.05＊ 216.42±67.35＊Agaricus blazei polysaccharide 285.72±78.15△120 57.36±8.14 38.24±6.75 4.76±1.35△△ 294.28±82.76 60 61.84±8.92 35.16±6.27 3.72±1.28△△

2.2 各組小鼠被動(dòng)回避測(cè)試結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠的逃避電擊潛伏期顯著縮短（P＜0.01），錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多（P＜0.01）。與模型組比較，姬松茸粗多糖組小鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠被動(dòng)回避測(cè)試結(jié)果Tab.2 Results of passive avoidance response of mice in various groups （n＝10，±s）

表2 各組小鼠被動(dòng)回避測(cè)試結(jié)果Tab.2 Results of passive avoidance response of mice in various groups （n＝10，±s）

＊ P＜0.01compared with normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group Incubation（t/s）Number of errors Normal 289.82±76.24 0.32±0.08 Model 204.63±72.51＊ 1.13±0.16＊Agaricus blazei polysaccharide 60mg·kg－1 265.71±69.54△ 0.49±0.13△△120mg·kg－1 261.45±67.58△ 0.41±0.09△△

2.3 各組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡率 與正常組比較，模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，姬松茸粗多糖組小鼠線粒體膜電位顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。姬松茸粗多糖高、低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡率Tab.3 Mitochondrial membrane potential and apoptotic rates of mouse hippocamal neuron in various groups（n＝10，±s）

表3 各組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡率Tab.3 Mitochondrial membrane potential and apoptotic rates of mouse hippocamal neuron in various groups（n＝10，±s）

＊ P＜0.01compared with normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group Mitochondrial membrane potential（fluorescence intensity relative value）Apoptotic rate（η/%）Normal 179.47±21.56 3.65±0.86 Model 126.35±13.71＊ 7.14±1.35＊Agaricus blazei polysaccharide 60mg·kg－1 148.36±15.27△△ 5.82±1.17△120mg·kg－1 165.81±19.34△△ 5.16±1.03△△

3 討 論

本研究分別采用Morris水迷宮和避暗儀測(cè)試小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[8－9]：以小鼠分別在水迷宮中心區(qū)、中環(huán)、外環(huán)的游泳距離占總游泳距離的百分比和第4象限游泳路程作為參數(shù)，記錄小鼠的探索平臺(tái)的過(guò)程，其關(guān)鍵在于小鼠在圍繞平臺(tái)的中心區(qū)域時(shí)間和路程；以被動(dòng)回避法記錄小鼠自放入明室到進(jìn)入暗室的時(shí)間和進(jìn)入暗室的次數(shù)，凡300s仍不進(jìn)入暗室者，反映記憶功能良好。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠在外環(huán)區(qū)的游泳距離占其總距離百分比顯著增多，中環(huán)和中心區(qū)域的游泳距離占總游泳距離的百分比顯著減少，第4象限游泳路程明顯減少，躲避電擊潛伏期顯著縮短，進(jìn)入暗箱的錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多，提示D－gal致衰小鼠出現(xiàn)明顯的記憶鞏固和再現(xiàn)障礙等腦老化跡象；給予姬松茸粗多糖后，衰老小鼠在中心區(qū)域游泳距離占其總距離百分比明顯提高，衰老小鼠在第四象限游泳路程增加，躲避電擊潛伏期明顯延長(zhǎng)，進(jìn)入暗箱的錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，提示姬松茸粗多糖可提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶和回避遭受電擊的能力，發(fā)揮延緩腦老化進(jìn)程的作用。

線粒體是真核細(xì)胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的細(xì)胞器，其主要功能是通過(guò)氧化磷酸化作用合成ATP，為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供能量。線粒體由兩層膜包被，外膜平滑，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴。線粒體中央由內(nèi)膜包繞為內(nèi)室，兩層膜之間為外室。內(nèi)膜存在有質(zhì)子泵，質(zhì)子泵將質(zhì)子從內(nèi)室泵出，進(jìn)入外室，從而形成內(nèi)室為負(fù)、外室為正的橫跨線粒體內(nèi)膜的線粒體膜電位，該電位對(duì)維持線粒體正常功能極為重要[10－11]。近年來(lái)，有關(guān)研究逐漸認(rèn)識(shí)到線粒體可能是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心[12]。有研究[13]報(bào)道：在多種誘導(dǎo)因素下均觀察到線粒體膜電位的下降，如：腫瘤壞死因子、化療藥物、糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中。線粒體膜電位的降低是細(xì)胞發(fā)生凋亡早期的一個(gè)不可逆變化[14]。穩(wěn)定線粒體膜電位成為抑制細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一[15]。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察姬松茸粗多糖對(duì)腦老化小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡發(fā)生率的影響，結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著提高，提示D-gal致衰老小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存在線粒體膜電位的異常，可能是小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期原因之一；給予姬松茸粗多糖后，小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位則顯著升高，細(xì)胞凋亡率則明顯下降，提示姬松茸粗多糖可提高衰老小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，該作用與姬松茸粗多糖改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。

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