王洪峰，董 理，王婷婷（.長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，吉林 長春 307；.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，吉林 長春 307）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是以部分或全身骨骼肌無力和極易疲勞為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其病情易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量。臨床治療中，一直以溴吡斯的明和免疫抑制劑為主要治療MG的藥物，但存在治療時(shí)間較長、副作用較大等問題[1]，故尋找新的治療手段勢在必行。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：MG屬于“痿證”的范疇，患者以脾氣虛弱、腎陽不足為主要病機(jī)，運(yùn)用中醫(yī)的針灸[2－3]、中藥[4－5]等療法治療MG具有良好的臨床療效，但由于相關(guān)的作用機(jī)制研究較少，阻礙了中醫(yī)藥療法的推廣應(yīng)用。大量的研究[6－10]證明：乙酰膽堿受體抗體（acetycholine receptor antibody，AchR-Ab）是MG的主要致病抗體，干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ）具有促進(jìn)AchR-Ab表達(dá)的作用，二者在MG的發(fā)病過程中具有重要的作用。本文作者針對MG的主要病機(jī)，采用以 “溫陽補(bǔ)氣”為主要治則的針灸療法治療MG，取得了良好的臨床療效。為進(jìn)一步研究“溫陽補(bǔ)氣”針法治療MG的作用機(jī)制，本研究采用國際公認(rèn)的免疫接種法建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）大鼠動(dòng)物模型，觀察該針法對EAMG大鼠血清中AchR-Ab和IFN-γ表達(dá)水平的影響，以期為針灸治療MG提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Lewis大鼠80只，雌性，6～8周齡，平均體質(zhì)量（162.2±4.7）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號碼：SCXK（滬）2007-0005，檢疫后送至長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 AchRα1 129-145多肽片段（美國Sigma公司），大鼠AchR-Ab ELISA檢測試劑盒（上海研輝生物科技有限公司），大鼠IFN－γ ELISA檢測試劑盒（上海研輝生物科技有限公司），溴吡斯的明（60mg/片，上海三維制藥有限公司）；Σ960型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Metertech公司），T-500型電子天平（美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司），GS-15R低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司），微量加樣器（日本 Nichiryo公司），0.25×25mm毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），艾絨（南陽綠瑩艾草生物制品有限公司）。

1.3 大鼠EAMG模型建立方法 選取SPF級Lewis大鼠60只，采用免疫接種法建立EAMG大鼠動(dòng)物模型。將AchRα1 129-145多肽片段按照1∶2比例與弗氏完全佐劑（CFA）完全乳化，配比按照200μL溶液內(nèi)含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的PBS液定容至20mL，充分混勻制成免疫乳劑，取一滴乳劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散為乳化好的標(biāo)志。首次免疫接種時(shí)，將上述抗原乳劑以300μL/只（含AchRα1 129-145 75μg）多點(diǎn)注射于大鼠四只足墊部、尾根部和背部。在首次免疫后第4和8周，分別進(jìn)行強(qiáng)化免疫接種，將AchRα1 129-145多肽片段以1∶2比例與弗氏不完全佐劑（IFA）完全乳化，配比按照200μL溶液含有50μg片段，不足部分用pH 7.4的PBS液定容至20mL，以200μL/只（含 AchRα1 129-145 50μg）多點(diǎn)注射于大鼠四只足墊部、尾根部和背部。以Lennon分級評分≥1分，同時(shí)AchR-Ab為陽性作為EAMG大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 動(dòng)物分組及治療方法 選取建模成功的EAMG大鼠30只，隨機(jī)分為針灸治療組、藥物對照組和模型對照組，每組10只，選取同期購進(jìn)未建模的SPF級Lewis大鼠10只設(shè)為空白對照組。針灸治療組大鼠予以 “溫陽補(bǔ)氣”針法治療，手三里（雙）直刺5mm，足三里（雙）直刺6mm，脾俞（雙）直刺6mm，腎俞（雙）直刺6mm，平補(bǔ)平瀉，針上加灸，30min·次－1，1次·d－1，7d為一療程，療程間休息1d，連續(xù)治療2個(gè)療程。藥物對照組大鼠予以溴吡斯的明灌胃治療，18.5mg·kg－1·d－1，連續(xù)治療15d。模型對照組和空白對照組大鼠不予特殊處置，同等條件下飼養(yǎng)，每日抓取1次，觀察一般情況。

1.5 檢測指標(biāo)及方法 大鼠血清AchR-Ab和IFN-γ表達(dá)水平的檢測：治療前后24h抽取大鼠尾根靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清中AchR-Ab和IFN－γ的表達(dá)水平，具體方法按上海研輝生物科技有限公司說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。大鼠血清中AchR-Ab和IFN－γ表達(dá)水平以±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠EAMG模型建模情況 從首次免疫接種后，造模大鼠約在第4周之后逐漸開始出現(xiàn)癥狀，如活動(dòng)減少、動(dòng)作減緩、掙扎力量減弱、叫聲降低和毛發(fā)變暗等，在第2～3次強(qiáng)化免疫接種之后，上述癥狀逐漸加重。在造模過程中，共死亡大鼠3只，均因MG癥狀過重死亡。在首次免疫接種后的第9周，對存活的57只大鼠進(jìn)行Lennon癥狀分級評分法和血清AchR-Ab表達(dá)水平檢測，共有31只大鼠Lennon分級評分≥1分，且AchR-Ab檢測為陽性，成模率為51.7%。

2.2 各組大鼠血清AchR-Ab表達(dá)水平 治療前，與空白對照組比較，針灸治療組、藥物對照組和模型對照組大鼠血清AchR-Ab表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后，與模型對照組比較，針灸治療組、藥物對照組大鼠血清AchR-Ab表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后針灸治療組和藥物對照組與治療前比較，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療后針灸治療組與藥物對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清AchR-Ab的表達(dá)水平Tab.1 Serum AchR-Ab expression levels of rats in various groups [n＝10，±s，ρB/（ng·L－1）]

表1 各組大鼠血清AchR-Ab的表達(dá)水平Tab.1 Serum AchR-Ab expression levels of rats in various groups [n＝10，±s，ρB/（ng·L－1）]

＊ P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.05 vs model control group；＃P＜0.05 vs before treatment.

Group AchR-Ab Before treatment After treatment Blank control 0.04±0.01 0.04±0.01 Model control 0.30±0.09＊ 0.33±0.10＊Drug control 0.29±0.08＊ 0.24±0.11△＃Acupuncture treatment 0.28±0.09＊ 0.22±0.12△＃

2.3 各組大鼠血清IFN-γ表達(dá)水平 治療前，與空白對照組比較，針灸治療組、藥物對照組和模型對照組大鼠血清IFN－γ表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后，與模型對照組比較，針灸治療組、藥物對照組大鼠血清IFN－γ表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后針灸治療組和藥物對照組與治療前比較，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療后針灸治療組與藥物對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IFN-γ的表達(dá)水平Tab.2 Serum IFN-γexpression levels of rats in various groups [n＝10，±s，ρB/（ng·L－1）]

表2 各組大鼠血清IFN-γ的表達(dá)水平Tab.2 Serum IFN-γexpression levels of rats in various groups [n＝10，±s，ρB/（ng·L－1）]

＊ P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs model control group；＃P＜0.01 vs before treatment.

Group IFN-γ Before treatment After treatment Blank control 20.67±0.98 20.47±1.37 Model control 220.65±2.61＊ 221.68±2.50＊Drug control 221.39±2.87＊ 55.8±4.21△＃Acupuncture treatment 221.07±2.74＊ 52.38±3.06△＃

3 討 論

MG以局部或全身橫紋肌在活動(dòng)時(shí)易于疲勞無力、經(jīng)休息或用抗膽堿酯酶藥物后可以緩解為主要臨床表現(xiàn)。在MG患者中，AchR-Ab與神經(jīng)肌肉接頭處（neuromuscular junction，NMJ）突出后膜的乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AchR）特異性結(jié)合，加速AchR的降解，導(dǎo)致突出后膜上AchR數(shù)量減少，阻礙了神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)，產(chǎn)生肌無力癥狀。臨床研究[11－12]發(fā)現(xiàn)：有85%～90%的全身型MG患者血清中可檢測出AchR-Ab，伴有胸腺腫瘤的 MG患者均可檢測出AchR-Ab，純眼肌型MG患者僅50%左右可檢測出AchR-Ab，MG病情的嚴(yán)重程度與AchR-ab滴度相關(guān)性不大，但與其活性關(guān)系密切[13]。IFN-γ是Th1類細(xì)胞因子，具有激活巨噬細(xì)胞、參與B細(xì)胞免疫應(yīng)答等多種免疫調(diào)節(jié)功能，在MG的發(fā)病過程中具有重要的作用[14]。國紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)：MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IFN－γ表達(dá)明顯高于健康對照者，尤其以急性期MG患者更為明顯，說明IFN－γ可能作為效應(yīng)因子參與了 MG的發(fā)病過程。王云甫等[16－18]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：EAMG大鼠T淋巴細(xì)胞IFN－γ的分泌及其表面IFN－γ受體的表達(dá)明顯升高，證明IFN－γ和IFN-γ受體的異常表達(dá)與MG的發(fā)病有關(guān)。

“溫陽補(bǔ)氣”針法在穴位配伍上，取手陽明經(jīng)穴之手三里，取足陽明經(jīng)穴之足三里，采用了 “治痿獨(dú)取陽明”的治療原則。同時(shí)，脾為 “后天之本”、“氣血生化之源”，腎為 “先天之本”、“藏命門之火”，根據(jù)MG脾氣虛弱、腎陽不足的主要病機(jī)選取脾俞、腎俞兩穴，通過溫補(bǔ) “先天之本”，健運(yùn) “后天之本”，以調(diào)節(jié)脾腎二臟之虛弱不足。因此，該針法在治療上具有溫補(bǔ)兼施、通調(diào)共奏的特點(diǎn)，能夠補(bǔ)益脾腎精血，健旺脾胃功能，使機(jī)體氣血津液充足、臟腑功能正常、筋脈得以濡養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)陽明實(shí)則宗筋潤，精氣足則筋骨強(qiáng)的治痿目的。本研究發(fā)現(xiàn)：EAMG大鼠動(dòng)物模型建模成功后，EAMG大鼠血清中AchR-Ab和IFN-γ的表達(dá)水平明顯升高，說明AchR-Ab和IFN－γ在EAMG的發(fā)病過程中具有重要的作用；經(jīng)針灸或藥物治療后，EAMG大鼠血清中AchR-Ab和IFN-γ的表達(dá)水平均明顯降低，且組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明針灸療法對MG具有良好的治療作用。同時(shí)可以推測：“溫陽補(bǔ)氣”針法對MG的治療作用是直接或間接降低了AchR-Ab和IFN-γ的表達(dá)水平，阻滯了AchR的降解和突出后膜上AchR數(shù)量的減少，從而保證了神經(jīng)電信號的正常傳導(dǎo)。

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