劉 穎，張 萱，劉純巖，倪文杰，毛洪濤，王珍琦（.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 002；2.吉林省婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 006；.吉林大學(xué)第二醫(yī)院科教科，吉林 長(zhǎng)春00；.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長(zhǎng)春00）

以往研究發(fā)現(xiàn)：精神分裂癥患者腦海馬組織的神經(jīng)前體細(xì)胞減少，海馬容積下降。越來(lái)越多的研究[1－4]發(fā)現(xiàn)：與精神分裂癥密切相關(guān)的易感基因，

其功能涉及成人神經(jīng)生成的調(diào)節(jié)，如DISC1基因和NPAS基因等。在精神分裂癥動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)其行為異常的同時(shí)伴有成年海馬生成障礙，并且這些異常可以通過(guò)運(yùn)動(dòng)增加成年海馬神經(jīng)生成而得到改善[5]，說(shuō)明加強(qiáng)神經(jīng)生成有助于精神分裂癥的恢復(fù)。精神藥物，特別是非典型抗精神病藥物和某些抗抑郁藥，能夠減輕一些或全部臨床癥狀，被證實(shí)能夠逆轉(zhuǎn)灰質(zhì)的丟失及海馬容積的下降[6]，因此這些藥物可能參與了改變組織結(jié)構(gòu)及增加神經(jīng)生成。然而，抗精神病藥物逆轉(zhuǎn)的機(jī)制尚未完全清楚。本文作者在以往的研究[7]中發(fā)現(xiàn)：奎硫平（quetiapine）能抵抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，提高神經(jīng)元存活率，減少乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，維持細(xì)胞膜的完整性，提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH水平，降低MDA水平，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究采用體外原代培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元復(fù)制谷氨酸損傷模型，在體外探討抗精神病藥奎硫平對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、壞死和細(xì)胞周期的影響，旨在闡明奎硫平對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 高糖和低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，馬血清為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清為北京圣馬生物制品研究所產(chǎn)品，多聚賴(lài)氨酸、胰酶和碘化丙啶（PI）和 Hochest33258（Ho）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，谷氨酸為上?；ぴ噭┭芯克a(chǎn)品，其余試劑為市售分析純。奎硫平由加拿大薩斯喀切恩大學(xué)李新民教授惠贈(zèng)。

1.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 取出生1d的Wistar大鼠（購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），經(jīng)75%的酒精消毒，無(wú)菌條件下開(kāi)顱取海馬；置于冷的無(wú)Ca2＋和Mg2＋的D-Hank’s液中，剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm的小塊；置于D-Hank’s管中靜止5min后，棄去上請(qǐng)，加入0.25%胰蛋白酶2mL，37℃消化15～20min，加入5mL培養(yǎng)液（高糖DMEM，10%胎牛血清，10%馬血清）終止消化；Paster滴管吹打，離心（1 500r·min－1，5min）2次，調(diào)細(xì)胞濃度為2×106mL－1。將細(xì)胞懸液加入事先用聚L-lysine處理過(guò)的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。第2天全換液，以后每3d換半液。

1.3 谷氨酸損傷模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn) [8]稍加改進(jìn)。神經(jīng)元培養(yǎng)至2周時(shí)，細(xì)胞成熟可用于實(shí)驗(yàn)。在應(yīng)用谷氨酸前6～12h，將海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無(wú)血清的培養(yǎng)液去除外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。實(shí)驗(yàn)時(shí)，吸去培養(yǎng)液，Tris緩沖液（25mmol·L－1Tris-HCl、120mmol·L－1NaCl、1.8mmol·L－1CaCl2、5.4mmol·L－1KCl和15mmol·L－1谷氨酸，調(diào)pH值為7.4）洗2次，加入終濃度為500μmol·L－1的谷氨酸，將奎硫平加入低糖、無(wú)血清培養(yǎng)基中，而后加入培養(yǎng)板中，空白培養(yǎng)液補(bǔ)足體積。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。模型復(fù)制完成后，通過(guò)MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率以判定模型復(fù)制成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)2周的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為3組。①正常對(duì)照組：吸除原有培養(yǎng)基，單純更換低糖DMEM培養(yǎng)基；②谷氨酸損傷組：吸除原有培養(yǎng)基，換成終濃度500μmol·L－1的低糖DMEM培養(yǎng)基；③奎硫平組：吸除原有培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度（0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0和500.0μmol·L－1）奎硫平且谷氨酸終濃度為500μmol·L－1的無(wú)血清、低糖DMEM培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別測(cè)定各組神經(jīng)元凋亡、壞死和細(xì)胞周期的改變。

1.5 細(xì)胞凋亡的測(cè)定 收集細(xì)胞，用8mL PBS 1 500r·min－1離心5min，共3次，加1mL PBS重懸細(xì)胞，用4mL冷乙醇固定，置－20℃冰箱過(guò)夜，離心（1 300r·min－1，5min），洗去固定液，加入PBS離心（1 300r·min－1，5min），棄上清。每 份 樣 品 加 RNase A（100mg·L－1）100μL，37℃ 孵 育 30min，加 PI（含 0.1%Triton X-100）300μL（50g·L－1），4℃避光負(fù)染30min，用流式細(xì)胞儀收集1×104個(gè)細(xì)胞，ModFit LT軟件分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞凋亡率（%）＝凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù) ×100%。

1.6 Ho和PI雙染檢測(cè)神經(jīng)元壞死率 用0.01%地塞米松作用3h作為細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性對(duì)照，0.1%Triton X-100作用1h作為細(xì)胞壞死的陽(yáng)性對(duì)照，每份樣品中加 Ho 150μL（100mg·L－1）、PI 100μL（0.05g·L－1），37℃溫育30min后，用流式細(xì)胞儀收集1×104個(gè)細(xì)胞，CellQuest軟件分析結(jié)果，記算細(xì)胞壞死率。壞死率（%）＝壞死細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù) ×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。神經(jīng)元凋亡率和壞死率以±s表示，組間比較均采用Student’st檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)元凋亡率 與正常對(duì)照組比較，谷氨酸損傷組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；與谷氨酸損傷組比較，10.0μmol·L－1和500.0μmol·L－1奎硫平組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01），而50.0～200.0μmol·L－1奎硫平組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組細(xì)胞壞死率 與正常對(duì)照組比較，谷氨酸損傷組細(xì)胞壞死率升高2.9倍（P＜0.05）；與谷氨酸損傷組比較，0.1μmol·L－1奎硫平組細(xì)胞壞死細(xì)胞率降低（P＜0.05），為谷氨酸損傷組的52.0%。見(jiàn)表1。

2.3 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期的變化 與正常對(duì)照組比較，谷氨酸損傷組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加（P＜0.01），S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降（P＜0.01），G2＋M期變化不明顯。與谷氨酸損傷組比較，10μmol·L－1奎硫平組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高（P＜0.05），為谷氨酸損傷組的105.2%，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），為谷氨酸損傷組的47.8%；200.0μmol·L－1奎硫平組 G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低（P＜0.05），為谷氨酸損傷組的68.9%，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高（P＜0.05），為谷氨酸損傷組的3.4倍。見(jiàn)表2。

表1 各組神經(jīng)元凋亡率和壞死率Tab.1 Apoptotic rates and necrotic rates of neurons in various groups （n＝3，±s，η/%）

表1 各組神經(jīng)元凋亡率和壞死率Tab.1 Apoptotic rates and necrotic rates of neurons in various groups （n＝3，±s，η/%）

“—”：Not detected.＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs glutamate injury group.

Group Concentration（μmol·L－1） Apoptotic rate Necrotic rate Normal control 0 1.4±0.4 15.3±0.6 Glutamate injury 500.0 4.3±0.5＊＊ 44.0±4.6＊Quetiapine 0.1 — 22.8±0.8△1.0 — 41.8±1.9 10.0 9.2±0.9＊＊△△ 37.8±3.8 50.0 1.9±0.3△△ 41.3±3.2 100.0 1.3±0.3△△ 42.1±1.9 200.0 1.1±0.1△ 45.2±0.7 500.0 17.8±1.5＊＊△△37.6±3.2

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycle of neurons in various groups （n＝3，±s，η/%）

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycle of neurons in various groups （n＝3，±s，η/%）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05 vs glutamate injury group.

Group Concentration（μmol·L－1）72.5±0.2 25.3±0.6 2.1±0.9 Glutamate injury 500.0 88.2±0.5＊＊ 11.5±0.5＊＊ 0.3±0.0 Quetiapine 10.0 92.8±0.5＊△ 5.5±1.3＊△ 1.8±1.0 50.0 89.6±2.4 10.2±2.6 0.3±0.2 100.0 76.8±13.2 23.0±13.3 0.3±0.2 200.0 60.8±6.8△ 39.2±6.7△ 0.1±1.0 500.0 91.6±2.8＊Percentag＋M Normal control 0 e of neurons G0/G1 S G2 7.8±3.0 0.6±0.4

3 討 論

近年來(lái)本課題組在抗抑郁藥和抗精神病的神經(jīng)保護(hù)作用方面進(jìn)行了大量的研究工作，獲得了一些有意義的 研 究 結(jié) 果[7－14]。在 以 往 的 研 究[7]中 發(fā) 現(xiàn)：抗精神藥奎硫平在體外實(shí)驗(yàn)中能抵抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。為進(jìn)一步證實(shí)該作用，并闡明其機(jī)制，本文作者在以往研究基礎(chǔ)上，采用體外原代培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元復(fù)制谷氨酸損傷模型，體外研究奎硫平對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。

本研究結(jié)果顯示：高濃度谷氨酸會(huì)影響體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的能量代謝，凋亡率和壞死率均明顯增加，且以細(xì)胞壞死為主；而奎硫平作用后，與谷氨酸損傷組比較，在中間濃度50.0～200.0μmol·L－1時(shí)抑制凋亡，在0.1μmol·L－1時(shí)降低壞死細(xì)胞比例。本研究結(jié)果還顯示：谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷使G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降；與谷氨酸損傷組比較，奎硫平使神經(jīng)細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生顯著變化；10.0μmol·L－1奎硫平組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低；200.0μmol·L－1奎硫平組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高。上述結(jié)果表明：奎硫平促進(jìn)神經(jīng)元存活的機(jī)制很可能是由其促進(jìn)S期細(xì)胞增殖、抑制凋亡和壞死實(shí)現(xiàn)的。

國(guó)外的一些動(dòng)物研究提示：抗精神病藥物對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的潛在作用機(jī)制在于這些藥物促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可促進(jìn)神經(jīng)生成和神經(jīng)存活。本研究從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期角度探討其機(jī)制在國(guó)內(nèi)外尚屬首次，這也可能為其機(jī)制的研究提供了新的線索，而要全面理解抗精神病藥對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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