仲苓芝，李文雪，李秀英，李新娜，李玉林，李榮貴

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021）

線粒體超氧化物歧化酶2（mitochondrial superoxide dismutase，SOD2）屬于金屬過氧化物歧化酶家族成員，是真核生物中的主要抗氧化酶，其在胞漿內(nèi)合成，移至線粒體發(fā)揮作用，在清除細(xì)胞活性氧化物中起重要作用。有研究[1－3]顯示：過氧化物和輻射等刺激能夠誘導(dǎo)SOD2基因的表達(dá)，且SOD2可以起到對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。研究[4－6]表明：SOD2基因在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)時能有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，而SOD2基因缺失的小鼠可出現(xiàn)皮膚及免疫系統(tǒng)衰老的征象，提示其在細(xì)胞的抗氧化保護(hù)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：SOD2基因在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中呈弱表達(dá)，本研究構(gòu)建pcDNA3.0-SOD2重組質(zhì)粒，觀察SOD2基因在HUVEC中的表達(dá)情況，并采用熒光定量PCR方法檢測其差異性表達(dá)，旨在為SOD2基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞 大腸桿菌DH5α購于大連寶生物工程有限公司，pcDNA3.0質(zhì)粒購于Invitrogen公司，HUVEC為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Pfu高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol試劑、DL2000DNA Marker及 DNA Markerλ-EcoT14購自大連寶生物工程有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶購自北京紐英倫生物技術(shù)有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑購自O(shè)xygen公司；Lipofectamine 2000購自 Invitrogen Life Technologies（Carlsbad，USA）。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI關(guān)于人SOD2編碼序列設(shè)計引物。為了定向克隆的方便，在上游引物和下游引物分別引入了EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列如下：Forward，5′-ACGTACCGGTATGTTGAGCCGGGCAGTGTGCG-3′；Reverse，5′-ACGTGAATTCTTACTTTTTGCAAGCCATGTATCTTTC-3′；隆片段為681bp。引物由上海生物工程公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基置于37℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞總RNA提取 應(yīng)用Trizol試劑按廠家說明書提取細(xì)胞總RNA；用酶標(biāo)儀于260和

280nm波長處測定吸光度（A）值，分別根據(jù)A260值及A260/A280比值確定RNA濃度和純度，根據(jù)凝膠電泳確定RNA樣品的完整性。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng) 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按廠家說明書進(jìn)行RT反應(yīng)，合成第一股cDNA。

1.7 PCR擴(kuò)增獲取人SOD2編碼區(qū) 應(yīng)用Pfu DNA聚合酶反應(yīng)體系按廠家說明書對上述獲得的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃ 延伸1min，35個循環(huán)；72℃ 延伸5min。PCR結(jié)束后每管取5μL加入6×loading buffer 1μL，混勻，上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。用紫外凝膠成像儀對PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行掃描照相。

1.8 pcDNA3.0-SOD2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 按照凝膠回收試劑盒說明書，對RT-PCR產(chǎn)物電泳的目的條帶進(jìn)行回收?；厥盏腟OD2片段與pcDNA3.0真核表達(dá)載體一起用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，T4連接酶連接，克隆至pcDNA3.0載體中。連接體系如下：1μL RT-PCR產(chǎn)物，1μL pcDNA3.0質(zhì)粒，ddH2O 19.5μL，混勻。45℃、5min，冰上1min，加入2.5μL DNA Ligase Buffer、1μL T4DNA Ligase后，16℃ 過夜連接。取100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入5μL連接產(chǎn)物，混勻后冰浴30min，42℃ 熱擊90s，冰浴2min，加入900μL LB培養(yǎng)基，37℃ 溫和振蕩復(fù)蘇細(xì)胞1h，取100μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐霉素的LB平板上，37℃孵箱倒置培養(yǎng)20h，觀察菌落生長情況。

1.9 菌落PCR鑒定重組陽性克隆 25μL反應(yīng)體系中加入Pfu Taq DNA聚合酶MIX混合物12.5μL，上、下游引物各1μL，加滅菌雙蒸水至25μL，用滅菌牙簽挑取單個圓滑菌落少許點(diǎn)入反應(yīng)體系中。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃ 延伸1min，30個循環(huán)；72℃ 延伸5min。PCR結(jié)束后每管取5μL加入6×loading buffer 1μL，混勻，上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。用紫外凝膠成像儀對PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行掃描照相。

1.10 pcDNA3.0-SOD2質(zhì)粒雙酶切 質(zhì)粒提取：取PCR鑒定含有重組質(zhì)粒的單一克隆，接種到含50mg·L－1氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r·min－1培養(yǎng)過夜。按照Axygen質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取的pcDNA3.0-SOD2質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相。

1.11 pcDNA3.0-SOD2 序 列 測 定 測 序 物 為pcDNA3.0-SOD2重組質(zhì)粒，引物 為 通 用 引 物PCDNAT7，測序結(jié)果與GenBank中的SOD2序列進(jìn)行對比。

1.12 pcDNA3.0-SOD2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HUVEC

按照Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行24孔板貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6h換IMDM培養(yǎng)液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.13 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后 HUVEC中SOD2基因表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，照相分析。

2 結(jié) 果

2.1 SOD2編碼區(qū)DNA片段的擴(kuò)增 從HUVEC提取的總RNA經(jīng)鑒定其純度和完整性均較好，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳得到約681bp的DNA條帶，即基因SOD2編碼序列CDS（669bp）加上兩端酶切位點(diǎn)的片段長度，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符（圖1）。

圖1 SOD2cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoregram of SOD2cDNA

2.2 pcDNA3.0-SOD2表達(dá)載體的篩選 應(yīng)用對菌落的直接PCR擴(kuò)增法篩選陽性克隆，以菌落上的少許菌體直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)：選取的5個菌落可見到681bp大小的陽性條帶（圖2），與預(yù)期片段大小一致，推測此克隆即為含有SOD2基因插入片段的陽性克隆。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SOD2的雙酶切鑒定選取陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行EcoRⅠ 和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見到681bp的條帶和載體片段（圖3），此克隆為插入有SOD2基因的重組質(zhì)粒。

圖2 SOD2陽性克隆PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoregram of PCR product of SOD2positive clones

圖3 pcDNA3.0-SOD2質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ 和XhoⅠ雙酶切凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel eletrophoregram of pcDNA3.0-SOD2 double-digested by EcoRⅠand XhoⅠ

2.4 表達(dá)載體的最終鑒定 將構(gòu)建的表達(dá)載體送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析，測序的部分圖譜見圖4，結(jié)果表明測序反應(yīng)完全可靠。DNA測序結(jié)果見圖5，表達(dá)載體包含SOD2全長編碼區(qū)的669核苷酸序列，與GenBank（NM-000636）報道結(jié)果完全一致。

圖4 表達(dá)載體測序圖譜Fig.4 Sequencing map of expression vector

圖5SOD2編碼區(qū)核苷酸序列Fig.5Nucleotide sequences of SOD2in encoding area

2.5 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HUVEC中SOD2的表達(dá)將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SOD2轉(zhuǎn)染 HUVEC后，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h，加入G418篩選有抗性的克隆細(xì)胞。收獲轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SOD2的HUVEC和空載對照組細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分析結(jié)果表明：與呈弱陽性條帶的對照組比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的目的條帶清晰可見。見圖6。

3 討 論

圖6 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HUVEC的RT-PCR結(jié)果Fig.6 RT-PCR result of HUVEC transfected with recombinant plasmid

SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫。在人和哺乳動物中，SOD分為：FeSOD（SOD1），存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；MnSOD（SOD2），位于線粒體中；Cu ZnSOD（SOD 3），為細(xì)胞外基質(zhì)超氧化物酶[7]。SOD2編碼的錳超氧化物歧化酶可以與氧化磷酸化作用的超氧化物副產(chǎn)物結(jié)合，從而將線粒體中產(chǎn)生的超氧離子清除，產(chǎn)生氧化能力相對較弱的過氧化氫。HUVEC是較易受到氧化損傷的一類細(xì)胞，在環(huán)境及藥物的持續(xù)刺激下，該細(xì)胞會呈現(xiàn)一定的氧化損傷繼而發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)：SOD2在HUVEC中呈弱表達(dá)。超氧陰離子（O2－）、過氧化氫等活性氧能引發(fā)多種病理效應(yīng)，導(dǎo)致癌癥、過敏、動脈硬化和老年癡呆等疾病[8－10]。研 究[11]發(fā) 現(xiàn)：過 氧 化 物 和 超 氧 化 物（ROS）等能夠誘導(dǎo)SOD2基因的轉(zhuǎn)錄，從而使低濃度的活性氧自動被機(jī)體清除。當(dāng)機(jī)體暴露于高水平的活性氧環(huán)境中時，由于線粒體中的DNA無組蛋白的保護(hù)和有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，因此很容易引起氧化損傷，并最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[12]。鑒于環(huán)境中輻射、氧化及生物體衰老等氧化應(yīng)激反應(yīng)的不可避免性，且機(jī)體正常情況下SOD2表達(dá)相對SOD1較低[13]，在人體正常細(xì)胞，尤其易受到氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)SOD2便顯得尤為重要。對于SOD基因的研究已經(jīng)用于防輻射、防缺血再灌注、抗自身免疫性疾病、抑制腫瘤和癌癥等方面。對于SOD2基因研究的生物學(xué)效應(yīng)也很廣泛，但SOD2基因在抗氧化及抗腫瘤中的具體作用途徑及機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。隨著人們對氧化應(yīng)激機(jī)制研究的不斷探索[14－16]，SOD2基因也日益廣泛地受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)克隆了SOD2DNA編碼區(qū)序列，構(gòu)建了pcDNA3.0-SOD2真核表達(dá)載體，并能在真核細(xì)胞中過表達(dá)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步的體內(nèi)研究及基因治療創(chuàng)造了條件，為研究SOD2在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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