田 晶，齊 玲，金 宏，陳 雪，王春艷

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013）

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科于洪泉主治醫(yī)師提供），0.25%胰蛋白酶和小牛血清（美國Gibco公司），NPPB及四甲基偶氮唑（MTT） （美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO） （美國Thermo公司）。取適量NPPB加入DMSO中，配制成終濃度為0.1mol·L－1的原液備用。

1.2 腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取

出凍存的人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞，迅速放入37℃水浴箱中復(fù)蘇，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.3 MTT法檢測(cè)SHG-44細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長期的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，

調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL－1。將細(xì)胞均勻接種于±s表示，組間比較采用

t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組SHG-44細(xì)胞的增殖活性 NPPB作用96孔板中，每孔100μL，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24h后加入NPPB（終濃度分別為0、50、100和200μmol·L－1），每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用3、24和48h，每孔再加入MTT 20μL，繼續(xù)孵育4h，棄上清每孔加入DMSO 150μL，震蕩15min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長處測(cè)定各孔吸光度（A）值，以不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4 細(xì)胞分析儀檢測(cè)SHG-44細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長期的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，平均接種于25mm×25mm培養(yǎng)瓶中，每瓶1×106細(xì)胞，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后加入NPPB（終濃度分別為0、50、100和200μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)24h。消化后用乙醇固定、染色，細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期。計(jì)算各組細(xì)胞的增殖指數(shù)，增殖指數(shù)＝（S＋G2）期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)/（G1＋S＋G2）期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.5 細(xì)胞分析儀檢測(cè)SHG-44細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長期的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，平均接種于4個(gè)25mm×25mm培養(yǎng)瓶中，每瓶1×106細(xì)胞，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后加入NPPB（終濃度分別為0、50、100和200μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)24h。消化后Annexin V/PI染色，細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。細(xì)胞增殖活性、不同周期細(xì)胞所占百分率及細(xì)胞凋亡率以3h即可促進(jìn)細(xì)胞增殖，200μmol·L－1NPPB組細(xì)胞增殖活性增加，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，100和200μmol·L－1NPPB組在24和48h時(shí)，細(xì)胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01）。隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長，NPPB對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用加強(qiáng)。見表1。

表1 各組SHG-44細(xì)胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of SHG-44cells in various groups （n＝5，±s）

表1 各組SHG-44細(xì)胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of SHG-44cells in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with blank control group.

Group A value（t/h） 3 24 48 Blank control 0.79±0.08 1.50±0.15 1.72±0.38 NPPB（μmol·L－1）50 0.75±0.05 1.46±0.21 1.29±0.12＊100 0.90±0.12 0.98±0.04＊＊ 0.70±0.04＊＊200 1.09±0.19＊0.87±0.13＊＊ 0.46±0.06＊＊

2.2 各組SHG-44細(xì)胞周期時(shí)相變化 細(xì)胞分析儀結(jié)果顯示：空白對(duì)照組G1期和S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為45.9%和23.1%，增殖指數(shù)為52.3%；在50μmol·L－1NPPB組，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，為40.6%，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降到19.6%，增殖指數(shù)為59.2%；在100μmol·L－1NPPB組，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯增多，為59.2%，而S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù) 降 到 14.5%，增 殖 指 數(shù) 為 40.6%；在200μmol·L－1NPPB 組，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為62.0%，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為15.5%，增殖指數(shù)為37.7%。與空白對(duì)照組比較，各濃度NPPB組不同周期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明低濃度NPPB促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度NPPB抑制細(xì)胞從G1期過渡到S期，使細(xì)胞增殖停滯在G0/G1期。見表2。

2.3 各組SHG-44細(xì)胞凋亡率 與空白對(duì)照組比較，100和200μmol·L－1NPPB組中細(xì)胞早期凋亡數(shù)與晚期凋亡數(shù)均明顯增加，凋亡率分別達(dá)到24.64%和 41.85%（P＜0.01）。說 明 高 濃 度NPPB能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有濃度依賴性。見圖1和表3。

表2 各組SHG44細(xì)胞周期時(shí)相Tab.2 Cell cycle of SHG－44cells in various groups（n＝3，±s，η/%）

表2 各組SHG44細(xì)胞周期時(shí)相Tab.2 Cell cycle of SHG－44cells in various groups（n＝3，±s，η/%）

＊ P＜0.01compared with blank control group.

Group Percentage of SHG-44cells G0/G1 S G2/M Blank control 45.90±1.08 23.10±0.62 29.20±0.59 NPPB（μmol·L－1）50 40.60±1.18＊ 19.60±0.60＊ 39.20±1.19＊100 59.20±0.36＊ 14.50±0.12＊ 26.10±0.26＊200 62.00±0.25＊ 15.50±0.06＊ 22.50±0.26＊

圖1 各組SHG-44細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups

3 討 論

近年來，在多種細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞普遍存在的容量調(diào)節(jié)氯通道（volume regulated anion channels，VRAC，ICl，vol）逐漸引起人們的關(guān)注。研究[1－5，7－10]表明：VRAC在細(xì)胞的容量調(diào)節(jié)、增殖、凋亡和遷移等功能中均有重要作用。細(xì)胞體積增加可以激活VRAC，通過調(diào)節(jié)性細(xì)胞體積減少和調(diào)節(jié)性細(xì)胞體積增加來 維持細(xì) 胞體積 的 穩(wěn) 定[1－3，7－8]。細(xì) 胞 增殖是通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。G1期是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的主要階段，蛋白質(zhì)、RNA和多聚核蛋白體都在此期合成，所以細(xì)胞容積明顯增大。目前發(fā)現(xiàn)多種抑制細(xì)胞增殖的氯通道阻斷劑均使細(xì)胞增殖停滯在G1期，這與本研究中100及200μmol·L－1NPPB抑制細(xì)胞增殖、使細(xì)胞增殖停滯在G1期的結(jié)果是一致的，說明VRAC參與細(xì)胞周期的進(jìn)程。He等[8]發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用VRAC阻斷劑DCPIB可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯在G1/S期，并發(fā)現(xiàn)這與減少CDK 4和cyclin D1表達(dá)、增加p27表達(dá)有關(guān)，推斷是通過影響ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作用的。本文作者發(fā)現(xiàn)：50μmol·L－1NPPB促進(jìn)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換，但低濃度及高濃度NPPB引起的差異原因需進(jìn)一步研究。VRAC在細(xì)胞凋亡中有重要作用。例如，氯通道阻滯劑NPPB阻抑順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡[3]，減 輕 氧 化 應(yīng) 激 引 起 的 C6 細(xì) 胞 損 傷[11]，VRAC受損使人肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥[12]，阻斷VRAC可阻止細(xì)胞凋亡[4]，一些促進(jìn)凋亡的中藥可以激活 VRAC[6，13]等。然而，也有研究[14]發(fā)現(xiàn)：阻斷VRAC可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。氯通道阻斷劑引起細(xì)胞凋亡還是抑制凋亡尚有待進(jìn)一步研究。

表3 各組SHG-44細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups （n＝3，±s，η/%）

表3 各組SHG-44細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SHG-44cells in various groups （n＝3，±s，η/%）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with blank control group.

Necrotic rate Blank control 0.47±0.36 3.70±0.57 4.17±0.90 Group Apoptotic rate Early apoptosis Late apoptosis Total apoptosis 2.16±0.40 NPPB（μmol·L－1）50 0.27±0.19 4.11±0.63 4.38±0.79 1.26±0.02＊100 2.57±1.41＊＊ 22.07±3.22＊＊ 24.64±4.17＊＊ 3.23±1.34 200 3.95±1.77＊＊ 37.90±7.95＊＊ 41.85±9.35＊＊4.74±2.86

目前研究[1，4－5，7]發(fā)現(xiàn)：VRAC 參與凋亡可能有2種機(jī)制。凋亡性體積減?。╝poptotic volume decrease，AVD）已在多種細(xì)胞凋亡中觀察到，被認(rèn)為是凋亡過程中具有普遍性意義的標(biāo)志性事件。有研究[4，7，11－12]發(fā)現(xiàn)：K＋和 Cl－經(jīng)鉀通道和 VRAC外流是細(xì)胞出現(xiàn)AVD的一個(gè)重要因素。而AVD是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡重要因素，給予VRAC阻斷劑能夠抑制凋亡性容積減少和細(xì)胞凋亡。另外，VRAC能夠通過轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3－直接降低細(xì)胞內(nèi)pH值，也能夠通過易化Cl－/HCO3－交換體分泌HCO3－來間接降低細(xì)胞內(nèi)pH值。細(xì)胞內(nèi)酸化后激活酸性核酸內(nèi)切酶，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡的過程[15－16]。本研究發(fā)現(xiàn)：高濃度NPPB可以抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，NPPB是通過阻斷VRAC發(fā)揮作用的還是另有其他途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖和凋亡的平衡失調(diào)密切相關(guān)，當(dāng)某一因素促進(jìn)細(xì)胞過度增殖并使凋亡減少時(shí)便促使腫瘤發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)：高濃度NPPB可以抑制細(xì)胞增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，說明NPPB可以作為抗腫瘤新藥進(jìn)行研究和開發(fā)。

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