王曉輝，張慶芳，遲乃玉

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素、甲殼質(zhì)，是由 β-1，4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖組成的直鏈多聚物，其含量在自然界中僅次于纖維素居第二位，據(jù)報(bào)道，海洋環(huán)境中每年就有超過 1011噸幾丁質(zhì)形成[1-2]。幾丁質(zhì)是多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，同時(shí)也存在于昆蟲的外殼和腸道中。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物幾丁寡糖、殼聚糖等低聚寡糖及 N-乙酰氨基葡萄糖等具有抗菌、抗腫瘤等活性，幾丁質(zhì)及其衍生物在化工、食品、化妝品、印染、造紙、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面都有廣泛用途[3-4]。自然界中幾丁質(zhì)的降解主要通過產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物代謝完成。

幾丁質(zhì)酶(Chitinase，EC3.2.1.14)是專一降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖或幾丁單糖的一組酶的總稱[5]。主要由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.2.1.14）、外切幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.2.1.14）和 β-N-乙酰己糖胺酶（β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52）組成。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶在高聚幾丁質(zhì)鏈內(nèi)隨機(jī)切割生成幾丁質(zhì)寡糖（chitooligosaccharides, (GlcNAc)n, n>2）；外切幾丁質(zhì)酶有兩種，分別從高聚幾丁質(zhì)鏈的還原端和非還原端依次切割下(GlcNAc)2；β-N-乙酰己糖胺酶將從非還原端將幾丁質(zhì)寡糖切割成為GlcNAc。某些物種中還發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，起到分散幾丁質(zhì)糖鏈?zhǔn)淖饔肹5-6]。根據(jù)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列同源性不同，將其分為18和19兩個(gè)家族。其中，18家族幾丁質(zhì)酶廣泛存在于病毒、微生物、植物和動(dòng)物中，而 19家族幾丁質(zhì)酶主要存在于植物中。此外，在鏈霉菌屬和部分?jǐn)M諾卡氏菌屬的放線菌中也發(fā)現(xiàn)了19家族幾丁質(zhì)酶，18家族和19家族幾丁質(zhì)酶之間沒有序列相似性，說明它們由不同祖先進(jìn)化而來[6]。

在海洋環(huán)境中，幾丁質(zhì)是最重要的營養(yǎng)源和能源[7]。海洋約占地球表面積的70%，具有高鹽（3.5%）、高壓（＞100 Mpa）、低溫、低光照、寡營養(yǎng)等特點(diǎn)，以及無光照、局部高溫（400 ℃）等極端生態(tài)環(huán)境，其中平均溫度為5℃的海水占總海水的90%，為適應(yīng)低溫環(huán)境，在其中生活的微生物，必然具備低溫環(huán)境下高催化活性的酶系[8-10]。本研究從海洋底泥樣品中篩到高產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株，并通過形態(tài)學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定，詳細(xì)優(yōu)化其生長特性與產(chǎn)酶條件，旨在獲得新酶源微生物資源，為酶的克隆表達(dá)及工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采自中國遼寧大連渤海海域近海底泥 5～100 m（123。396，E, 39。7014，N），樣品采集后迅速裝入無菌保鮮袋凍存于-20 ℃冰柜，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)至-80 ℃。

1.2 試劑與儀器

幾丁質(zhì)粉chitin (C8H13NO5)n，N-乙酰氨基葡萄糖購自美國 Sigma-aldrich公司,胰蛋白胨 (Tryptone)購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

LRH系列生活培養(yǎng)箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；IX73型顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 膠體幾丁質(zhì)的制備[11]

取10.0 g幾丁質(zhì)置于研缽，于通風(fēng)櫥內(nèi)緩慢加入100 mL，85%的濃磷酸，同時(shí)不斷的用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。將研缽用保鮮膜封口，4℃下過夜。然后，用大量的蒸餾水沖洗，直到pH為5.0左右后離心，用緩沖液（如0.1 M磷酸緩沖液，pH7.0）定容為1 L。配制成1%膠體幾丁質(zhì)溶液，避光保存于冰箱備用。

1.4 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)10.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

2216E種子培養(yǎng)基[11]：牛肉膏1.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；

2216E保藏培養(yǎng)基[11]：牛肉膏1.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，原地海水配制，pH自然。

1.5 酶活檢測(cè)

取粗酶液0.1 mL與0.9 mL，1%膠體幾丁質(zhì)混合，20℃下保溫30 min后，將反應(yīng)混合物加熱在沸水浴中10 min終止酶反應(yīng)，10,000×g離心5 min，取上清0.5 mL，加入 1 mL Schales’試劑[12]，沸水浴 10 min，測(cè)定OD420nm，設(shè)3個(gè)重復(fù)，取平均值，根據(jù)N-D--乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。酶活單位定義(U)：在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。

1.6 產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株的篩選方法

1.6.1 菌株的初篩

稱取10.0 g海洋底泥，放入盛有90 mL無菌水及玻璃珠的三角瓶中，150 r/min振蕩15 min使樣品充分分散混勻，按梯度（10-5，10-6等）稀釋后涂布于含有膠體幾丁質(zhì)的篩選培養(yǎng)基平板。20℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取產(chǎn)生透明圈比較明顯的菌株進(jìn)行多次劃線純化，并結(jié)合顯微鏡觀察得到純菌株。

1.6.2 產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株的復(fù)篩

將單菌落挑取一環(huán)，接種于5 mL種子培養(yǎng)基，

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]。

1.8 生長曲線與產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

1.8.1 生長曲線的測(cè)定

挑取單菌落接入5 mL，2216E液體種子培養(yǎng)基，20℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL，2216E的液體種子培養(yǎng)基中，做3瓶，每隔2或4 h取樣測(cè)OD600nm，取平均值，繪制生長曲線。

1.8.2 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

挑取單菌落接入5 mL，2216E種子培養(yǎng)基，20℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，做3瓶，每隔2 h取樣測(cè)酶活。20℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃、150 r/min培養(yǎng)3d后取樣，將發(fā)酵液12000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液測(cè)酶活。

1.7 菌株鑒定

1.9 產(chǎn)酶條件試驗(yàn)

挑取單菌落接入5 mL2216E種子培養(yǎng)基中，在20℃下、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于不同碳源、氮源、溫度、pH、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)30 h，測(cè)定酶活性，考察不同產(chǎn)酶條件對(duì)低溫幾丁質(zhì)產(chǎn)生菌的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株篩選與鑒定

采用膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的分離平板從海洋底泥樣品中初篩出菌株，然后將菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基制備粗酶液檢測(cè)酶活，進(jìn)一步確認(rèn)該菌株產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶。采用雙重指標(biāo)進(jìn)行篩選，能有效避免篩選出假陽性菌株，獲取真正產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定且活性高的菌株。

本實(shí)驗(yàn)分離到產(chǎn)透明圈較大的菌株13株，選取產(chǎn)生透明圈最大、最穩(wěn)定產(chǎn)酶的一株菌命名為DL-06。菌株DL-06(圖1)單個(gè)菌落呈淡黃色，半透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，菌苔粘稠，菌體呈桿狀，可見單個(gè)散生或形成兩個(gè)聚集，革蘭氏染色陰性。

圖1 菌株DL-06的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)（×1000）

2.2 產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株生長曲線與產(chǎn)酶曲線測(cè)定

菌株 DL-06生長曲線與產(chǎn)酶隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖2所示。由生長曲線可以看出，20℃培養(yǎng)時(shí)，菌株0～6 h為延滯期，6～30 h為對(duì)數(shù)期，30～50 h為穩(wěn)定期，50后緩慢進(jìn)入衰亡期。同時(shí)該菌株培養(yǎng)20～30 h內(nèi)其酶活呈現(xiàn)陡增態(tài)勢(shì)，30 h時(shí)酶活達(dá)最大值為1.884 U/mL，相應(yīng)菌密度為最大值，30 h后發(fā)酵液中酶活逐步下降。確定該菌株最適培養(yǎng)時(shí)間為30 h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)低溫幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌DL-06生長曲線及產(chǎn)酶影響

2.3 海洋細(xì)菌DL-06產(chǎn)酶條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株 DL-06產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶的單因素條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括最佳碳源、最佳氮源、起始pH、溫度和接種量等優(yōu)化研究，每個(gè)因素設(shè) 3個(gè)平行。

接種低溫幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌DL-6單菌落于2216E種子培養(yǎng)基，150 r/min，20℃下培養(yǎng)14 h后，再次重新接種新鮮配制的種子培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，用作優(yōu)化產(chǎn)酶單因素條件的種子。

2.3.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種菌株 DL-06種子于分別以膠體幾丁質(zhì)、粉末幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、微晶纖維素為碳源(濃度5.0 g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測(cè)酶活。由圖3可以看出膠體幾丁質(zhì)和粉狀幾丁質(zhì)是菌株 DL-06較好的產(chǎn)酶碳源，該菌株具有較好的降解晶體狀粉末幾丁質(zhì)能力，具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖雖然是脫乙酰的幾丁質(zhì)，但并不易于誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，推測(cè)該菌株利用脫乙酰碳源底物的能力相對(duì)較差；羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和微晶纖維素有一定的誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力，說明來源于菌株 DL-06的幾丁質(zhì)酶具有廣泛的底物特異性，且具備較弱的纖維素酶活性，這與纖維素和幾丁質(zhì)兩大不溶晶體多糖相似結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相關(guān)。

圖3 碳源對(duì)菌株DL-06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.3.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

菌株分別以有機(jī)氮源酵母粉、胰蛋白胨和牛肉膏，無機(jī)氮源硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉和尿素(濃度5.0 g/L)為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測(cè)酶活。結(jié)果表明菌株 DL-06利用胰蛋白胨作為氮源產(chǎn)酶活力較高，推測(cè)是因?yàn)橐鹊鞍纂诉@種有機(jī)氮源含有一定的生長因子等，更容易被菌體吸收利用；另外，無機(jī)氮源中尿素產(chǎn)酶能力較高(圖4)。

圖4 氮源對(duì)菌株DL-06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和 50℃，150 r/min 培養(yǎng) 30h，檢測(cè)酶活。由圖 5可以看出，菌株產(chǎn)酶最佳溫度為20℃，隨著培養(yǎng)溫度升高，產(chǎn)酶能力迅速降低，表明菌株適合低溫產(chǎn)酶，分泌低溫幾丁質(zhì)酶。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株DL-06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.3.4 起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃，150 r/min培養(yǎng)30 h，檢測(cè)酶活。結(jié)果表明菌株DL-06在pH7.0時(shí)產(chǎn)酶活力最高，為4.129 U/mL，pH 12.0時(shí)菌株仍保持48%的酶活力，說明菌株比較適合堿性的產(chǎn)酶環(huán)境，這可能與其分離環(huán)境渤海灣水域底泥偏堿性有關(guān)(圖 6)。

圖6 起始pH值對(duì)菌株DL-06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.3.5 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖7可以看出，海洋菌株在不同接種量下，幾丁質(zhì)酶活力區(qū)別明顯。從圖中走勢(shì)可以看出，當(dāng)接種量為2%時(shí)，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量最高。此后，接種量越大酶活越低，由于250 mL三角瓶發(fā)酵體積較小，如果接種量過大，菌種大量繁殖，快速消耗營養(yǎng)物質(zhì)，不利于菌種產(chǎn)酶，但接種量較小，發(fā)酵液中營養(yǎng)相對(duì)豐富，有利于縮短延滯期，快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，利于菌種產(chǎn)酶。故2%為海洋菌株的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵接種量。

2.3.6 裝瓶量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖8可以看出，海洋菌株在裝瓶量為60%較高，低于或高于此酶活力均較低。由于裝瓶量主要影響的是溶氧含量，可知該菌種對(duì)溶氧量要求并不嚴(yán)苛。由此，裝瓶量60%為海洋菌株的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵溫度。

圖7 接種量對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

圖8 裝瓶量量對(duì)菌株DL-06產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響

2.3.7 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

選取搖床轉(zhuǎn)速為70 r/min、90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min，20℃培養(yǎng)30 h測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖9。菌株產(chǎn)酶受轉(zhuǎn)速影響較小，當(dāng)轉(zhuǎn)速為 130 r/min時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為 2.737 U/mL。轉(zhuǎn)速為70 r/min時(shí)酶活最低為0.897 U/mL，仍保持32.7%酶活。表明該菌種為兼性厭氧菌，雖然該菌在有氧條件下比無氧條件下生長好，但厭氧環(huán)境更易產(chǎn)酶。因此培養(yǎng)轉(zhuǎn)速確定為130 r/min。

圖9 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4 最佳產(chǎn)酶條件下產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

通過細(xì)菌 DL-06產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶條件的優(yōu)化，其產(chǎn)酶量有所增加，以最佳的產(chǎn)酶條件發(fā)酵菌株DL-06產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶。即膠體幾丁質(zhì)5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，20℃，pH 7.0，2%接種量，裝液量60%，130 r/min，陳海水1.0 L，發(fā)酵30 h，檢測(cè)酶活力達(dá)6.87 U/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究采用膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基，對(duì)采自大連渤海底泥樣品進(jìn)行菌株初篩，然后酶活力檢測(cè)復(fù)篩得到1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為革蘭氏陰性桿菌。目前文獻(xiàn)所報(bào)道菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力高低不同，且酶活測(cè)定方法、酶活單位的定義及表示方式等差別，給菌株之間酶活力大小的比較帶來不便[14-15]。

一般微生物幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度為40～50℃[16-17]，且在高溫下容易失活。我們篩選菌株DL-06分泌的幾丁質(zhì)酶最適作用溫度為20℃，屬于低溫幾丁質(zhì)酶，該酶作用溫度接近于室溫環(huán)境，省去工業(yè)生產(chǎn)中冷卻與加熱環(huán)節(jié)，不僅節(jié)約能源且降解生產(chǎn)成本，具有工業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。據(jù)報(bào)道[18]幾丁質(zhì)酶最適催化pH范圍較大，多在pH 3.0～11.0，但絕大多數(shù)微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶最適催化 pH 4.0～6.0的偏酸環(huán)境，pH 3.0～11.0時(shí)通常都比較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)菌株DL-06分泌的幾丁質(zhì)酶最適催化pH 7.0，屬于中性幾丁質(zhì)酶，但在pH 12.0仍有較高酶活性，有一定嗜堿性。幾丁質(zhì)酶多為誘導(dǎo)酶，培養(yǎng)基中需要幾丁質(zhì)或幾丁質(zhì)衍生物等底物的誘導(dǎo)，本研究菌株 DL-06也是一樣，且本研究菌株具有較高降解粉狀幾丁質(zhì)能力，同時(shí)還表現(xiàn)較弱的纖維素酶活性，具有潛在應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)篩選到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高的海洋細(xì)菌DL-06，通過單因素方法優(yōu)化其最佳的產(chǎn)酶條件，優(yōu)化后該菌產(chǎn)酶活性較高達(dá)6.87 U/mL。該菌產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶具有潛在工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用價(jià)值，為下一步系統(tǒng)的研究其幾丁質(zhì)酶系及其編碼基因做好了基礎(chǔ)工作。

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