殷香保，鄔林泉，黃明文，羅志強(qiáng)，余新，黃俊，邢宏松

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 普外科，江西 南昌 330006)

阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物的制備及藥代動(dòng)力學(xué)研究

殷香保，鄔林泉，黃明文，羅志強(qiáng)，余新，黃俊，邢宏松

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 普外科，江西 南昌 330006)

目的研究阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物的制備及藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。方法以聚乳酸、殼聚糖為原料，采用復(fù)乳法制備阿霉素納米微粒；以碳化二亞胺（EDC）為交聯(lián)劑，采用分子交聯(lián)技術(shù)將阿霉素納米與VEGFR2單抗進(jìn)行分子交聯(lián)，制備阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物；ELISA法分析交聯(lián)物的免疫性反應(yīng)；再以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究交聯(lián)物在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果制備的阿霉素納米在掃描電鏡下為較均一的球形顆粒，粒徑為（160±34）nm，載藥量為和包封率分別為（30．15±3．5）%和（80．56±4．24）%。制備的阿霉素納米-VEGFR2 單抗交聯(lián)物保留了 VEGFR2 與 IV 型膠原酶以及表達(dá)IV型膠原酶的H 22細(xì)胞的免疫結(jié)合活性。交聯(lián)物對(duì)阿霉素有良好的控制釋放作用，能夠有效降低血藥峰濃度，并延長(zhǎng)藥物在血液中的滯留時(shí)間。結(jié)論阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物保留了VEGFR2單抗的免疫性，在動(dòng)物體內(nèi)具有良好的緩釋性。

VEGFR2單抗；阿霉素；納米微粒

本研究制備了阿霉素納米與VEGFR2單抗的免疫交聯(lián)物并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌H22移植性腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)采取傳代培養(yǎng)的方式培養(yǎng)細(xì)胞。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，由南昌大學(xué)提供，合格證號(hào)：96-021。

1.1.3 藥物與試劑 VEGFR2單抗以Sephadex G-200層析柱從大鼠雜交瘤腹水中純化。阿霉素（Adriamycin，ADM）購(gòu)自意大利Farmitalia公司。牛血清白蛋白、2-亞氨基四氫噻吩、多聚賴氨酸、IV型膠原酶、N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基) 苯甲酸酯等均購(gòu)自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為光明試劑提供。

1.3.4 儀器 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1 D， 蘇州凈化設(shè)備有限公司），島津UV 2120202型紫外可見分光光度計(jì)，CO2培養(yǎng)箱（SANYO MCO-15 AC），酶標(biāo)儀（Heraeus Multifuge X1 R），低溫高速離心機(jī)（時(shí)代北利，GT 10-1），掃描電子顯微鏡（卡爾·蔡司，EVO 18），動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀（Cordouan，VASCO 2）。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素納米微粒（ADM-NP）的制備 初乳液的配制：適量ADM溶液在超聲條件下與10 mL聚乳酸二氯甲烷溶液混合，隨后加入少量混合乳化劑(Tween 80∶Span 80=6∶1)。初乳液隨后在超聲條件（10 min，80 w）下滴加到40 mL O-CMC水溶液中形成復(fù)乳液。復(fù)乳液在室溫條件下電磁攪拌6 h，形成 ADM-NP混懸液?；鞈乙弘x心（3000 g×5 min），沉淀物用蒸餾水洗滌3次以上，得到的沉淀采用冷凍干燥方式得ADM-NP，儲(chǔ)存?zhèn)溆肹8]。

1.2.2 ADM-NP的檢測(cè) 將適量的ADM-NP溶液滴在載玻片上，用吹風(fēng)機(jī)將其吹干，放在噴金儀下做噴金處理，之后在環(huán)境掃描電鏡下觀察其形態(tài)。為了檢測(cè)阿霉素納米微粒的粒徑大小，取適量稀釋后的ADM-NP溶液在用動(dòng)態(tài)光散射粒子分析儀于633 nm下觀察。

1.2.3 ADM-NP的載藥量和包封率計(jì)算 前處理：將ADM-NP溶解于PE中與水混懸，靜置過夜，取水相溶液離心（3000 g×5 min）。上清液用HPLC測(cè)定其阿霉素的含量。載藥量和包封率的計(jì)算公式分別為：載藥量=（ADM-NP中ADM質(zhì)量/ADM-NP質(zhì)量）×100%，包封率=（ADM-NP中ADM質(zhì)量/制備相應(yīng)量納米微粒所需ADM質(zhì)量）×100%。

1.2.4 阿霉素納米-VEGFR2交聯(lián)物的制備 取制備好的ADM-NP溶于磷酸鹽緩沖液中（0.5 M，pH 6.8）調(diào)整為5 g/L，加入4 g/L碳化二亞胺，4℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，加入純化后的VEGFR2單抗（5 g/L）反應(yīng)4 h。然后再次加入EDC室溫下反應(yīng)1 h，隨后在4℃下靜置過夜。然后置截留分子量為10 kDa的透析袋中，于0.05 mol/L（pH 6.8）的PBS中充分透析16 h。透析完畢，得到VEGFR2單-ADM交聯(lián)物。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%BSA的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系H22 cell，孵箱中傳代培養(yǎng)條件為：37℃，5%CO2。用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心洗滌細(xì)胞，在倒置顯微鏡下將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為6×105/mL。

1.2.6 ELISA法測(cè)定VEGFR 2-ADM交聯(lián)物免疫性反應(yīng)將IV型膠原酶溶解在PBS中配成10 mg/L溶液。按100 uL/孔包被96孔板，然后置于4℃過夜。H22 cell的固定：按200 uL/孔在96孔板中加入0.01%多聚賴氨酸，4℃靜置過夜。除去包被液，并用PBS沖洗1～3次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H 22細(xì)胞，按10×104細(xì)胞/孔加至 96孔板。離心（800×g，5 min）除去上清液，按50 uL/孔加入0.05%的戊二醛，反應(yīng)20 min。96孔板用磷酸緩沖液洗3次后，按2 uL/孔用1%BSA封孔過夜。隨后用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）沖洗3～5次。按50 uL/孔加入VEGFR2單抗和VEGFR 2-ADM交聯(lián)物，設(shè)置3個(gè)平行濃度，于37℃培養(yǎng)箱中孵育40 min。以PBST洗板5次，隨后按50 uL/孔加入2500倍稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體，于37℃培養(yǎng)箱中孵育40 min，96孔板再次用PBST沖洗6次。然后，按100 uL/孔加入1，2-苯二胺，室溫黑暗下反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成后，立即按100 uL/孔加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光值。

1.2.7 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將SD大鼠，隨機(jī)分成2組，每組10只。每組分別經(jīng)尾靜脈注射阿霉素納米-VEGFR2交聯(lián)物（交聯(lián)物組，10 mg/kg體重）或游離阿霉素溶液（F-ADM組，10 mg/kg 體重）。分別在給藥 0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、48、96、144、192、240 h后剪尾采集 0.6 mL血液作樣品，保存于肝素抗凝管，離心（3000 g×10 min），上清血漿保存于4℃冰箱中。向上清液中加入2 mL甲醇，充分搖勻后再次離心（5000 g×5 min）。采用HPLC法測(cè)定其中阿霉素濃度。數(shù)據(jù)采用3P 87軟件進(jìn)行模型擬合運(yùn)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測(cè)定結(jié)果采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組正態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)值均以“±s”表示。組間差異主要采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADM-NP的檢測(cè)結(jié)果 掃描電鏡下觀察到制備的ADM-NP的表觀形態(tài)如圖1所示。結(jié)果顯示ADM-NP呈球形結(jié)構(gòu)，大小較均一，經(jīng)檢測(cè)ADM-NP的粒徑為（160±34）nm。

圖1 掃描電鏡下的ADM-NP圖Fig.1 ADM-NP chart under scanning electron microscopy

2.2 載藥量和包封率 測(cè)定結(jié)果顯示ADM-NP的載藥量和包封率分別為（30.15±3.5）%和（80.56±4.24）%。

2.2 阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物免疫反應(yīng)性 以ELISA方法測(cè)定結(jié)果見圖2和3，阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物仍然能與IV型膠原酶以及表達(dá)IV型膠原酶的H 22細(xì)胞進(jìn)行免疫結(jié)合，但其免疫結(jié)合能力與VEGFR2單抗相比，其結(jié)合抗原的能有所降低。

圖2 阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物與IV型膠原酶的免疫反應(yīng)性Fig.2 Immunoreactivity of Adriamycin Nanoparticles-VEGFR2 MAbs crosslinked product and Type IV collagenase

圖3 阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物與H 22細(xì)胞的免疫反應(yīng)性Fig.3 Immunoreactivity of Adriamycin Nanoparticles-VEGFR2 MAbs crosslinked product and H 22 cells

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果 如圖4所示，在給藥后F-ADM組藥物濃度迅速下降。F-ADM組的ADM濃度在150 h后即測(cè)不出；而交聯(lián)物組的ADM濃度下降緩慢，并且在2 h后ADM濃度一直高于F-ADM組，240 h時(shí)HPLC仍可測(cè)到血藥濃度（0.323 mg/L）。結(jié)果表明，阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物在小鼠體內(nèi)對(duì)ADM有良好的控制釋放作用，可降低血藥峰濃度，并能明顯延長(zhǎng)藥物在血液中的保留時(shí)間。數(shù)據(jù)采用3P 87軟件分析顯示，其符合三室模型（見表1）。另外，在消除半衰期（t 1/2 β）、曲線下面積（AUC）、平均滯留時(shí)間（MRT）方面，交聯(lián)物組明顯大于F-ADM組（P＜0.01），表明阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物在體內(nèi)有良好的緩釋性。

圖4 2組小鼠中阿霉素濃度隨時(shí)間變化圖Fig.4 Time change map of Adriamycin concentration in Mice

表1 阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物和F-ADM在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of Adriamycin Nanoparticles- VEGFR 2 MAbs crosslinked product and F-ADM in Mice(n=5)

3 討論

載藥納米微粒是一種近年來研究較多的新型藥物緩釋體系。應(yīng)用特定的包裹材料，采用納米技術(shù)，可將某些藥物，如化療藥物和抗生素等制備成納米微粒。這種納米微粒進(jìn)入機(jī)體后，包裹在微粒中的藥物可緩慢釋放，起到緩釋治療效果。載藥納米微粒為延長(zhǎng)化療藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，增加藥物對(duì)腫瘤組織的靶向性提供了一種可能，在藥物輸送方面具有許多優(yōu)越性。

在納米制備過程中我們所采用的初乳液乳化劑為Tween 80與Span 80的混合型乳化劑。Tween 80與Span 80的混合劑在油水界面上能夠形成分子空間緊密排列的絡(luò)合物，能夠有效阻止乳液液滴的聚合，提高乳液穩(wěn)定性，并且具有分離提純方法十分簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[8]。O-羧甲基殼聚糖作為復(fù)乳液乳化劑，兼具水溶性及乳化性能良好的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能起到修飾納米微粒表面的作用。另外，它可連接其它靶向性物質(zhì)，從而提高了納米微粒的靶向性。

阿霉素是一種由肽鏈和發(fā)色團(tuán)兩個(gè)部分組成的抗腫瘤藥、細(xì)胞毒類藥物。其肽鏈部分本身沒有細(xì)胞毒性，其作用是穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)和活性。根據(jù)這一特點(diǎn)，本研究以EDC作為交聯(lián)劑，VEGFR2單抗與ADM-NP的表面的修飾物殼聚糖（O-CMC）相連接形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，得到了以1∶1分子比連接產(chǎn)物為主的阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物，在進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)溶酶體降解釋放出藥物，易于發(fā)揮導(dǎo)向作用。

結(jié)果顯示，阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物在和IV型膠原酶或H22細(xì)胞的結(jié)合能力上有所降低，但部分抗原結(jié)合活性仍然存留下來。以靜脈給藥的方式，HPLC法分析其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物與F-ADM相比，阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物對(duì)ADM表現(xiàn)出良好的控釋作用，能夠有效降低血藥峰濃度，并延長(zhǎng)ADM在血液中的滯留時(shí)間。如后期研究能證明阿霉素納米-VEGFR2單抗交聯(lián)物能提高對(duì)腫瘤組織的靶向性，將具有比游離ADM更高的療效，為其臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Preparation and pharmacokinetics study of immunoconjugate composed of Adriamycin nanoparticles and VEGFR2 monoclonal antibody

YIN Xiang-bao, WU Lin-quan, HUANG Ming-wen, LUO Zhi-qiang, YU Xin, HUANG Jun, XING Hong-song
(Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006,China)

ObjectiveTo prepare the immunoconjugate composed of Adriamycin nanoparticles and VEGFR 2 monoclonal antibody(conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb) and study its pharmacokinetics property.MethodsAdriamycin nanoparticles were prepared by using double emulsion method, with PLA and O-CMC as materials. Conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb was prepared by using molecule conjugate technology.Immunoreactivity of the conjugate with type IV collagenase and H22 cell were analyzed by using ELISA. Pharmacokinetics parameters of the immunoconjugate were obtained by using SD rats as study objects.ResultsThe prepared ADM-NP was sphere particles under SEM, which diameters were (160±34) nm. The drug loading rate and entrapment rate were (30.15±3.5)% and (80.56±4.24)% respectively. Conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb was successfully prepared, which had immunoreactivity with type IV collagenase and H22 cell. The immunoconjugate showed good ADM control-release ability and could prolong the retention time of ADM in vivo.ConclusionConjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb keeps the immunoreactivity of VEGFR 2-MAb and shows good ADM control-release ability.

VEGFR 2 monoclonal antibody; Adriamycin; nanoparticle

R 969．1

A

1005-1678(2014)02-0068-04

目前，化學(xué)治療仍然是治療肝癌，尤其是中晚期肝癌的重要手段。傳統(tǒng)的全身化療方法由于存在的眾多缺點(diǎn)，化療效果一直不盡人意。近年來，藥物緩釋治療逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)如李力軍等[1]采用放射性125I粒子和5-FU緩釋化療粒子聯(lián)合局部植入技術(shù)治療復(fù)發(fā)性直腸癌，取得了滿意效果。

近年來在許多惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，在肝癌組織中的陽(yáng)性率較高[2]。VEGF能促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2）是一種介導(dǎo)VEGF在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮功能的主要受體，對(duì)腫瘤血管生成極其重要[4-5]。利用VEGFR2單抗與VEGFR2特異性受體結(jié)合的特性，可將某些治療性成分如抗腫瘤藥物或毒素等攜帶至腫瘤組織中，發(fā)揮免疫靶向治療作用[6-7]。

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2008 GQY 0050）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)資助項(xiàng)目（81060187）

殷香保，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：肝癌的綜合治療與防治，E-mail：zhoudinggeng@163.com。