馬強(qiáng)，吳倩，李素霞

（生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)，上海 200237）

R 122 L突變提高重組人陰離子型胰蛋白酶的穩(wěn)定性的研究

馬強(qiáng)，吳倩，李素霞Δ

（生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)，上海 200237）

目的研究自切位點(diǎn)突變R 122 L對(duì)重組人陰離子型胰蛋白酶穩(wěn)定性的影響。方法在大腸桿菌中表達(dá)重組人陰離子型胰蛋白酶和R 122 L突變體，并進(jìn)行純化，對(duì)純化后酶及其突變體的穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果mhT 2（R 122 L）發(fā)揮催化活力的最適pH為7～11；低溫及酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較好，其活力在pH 7．6條件下同樣能被典型的金屬離子螯合劑（如EDTA）、還原劑（如β-ME）、變性劑、Fe3+及絲氨酸蛋白酶抑制劑所抑制，以N-苯甲酰-L-精氨酸（n-benzoyl-l-arginine ethyl ester，BAEE）作為底物時(shí)的米氏常數(shù)為0．010 mmol/L。結(jié)論相比于hT2野生型，R 122 L突變體蛋白最適pH范圍增大，耐熱性能也有所提高，與底物BAEE的親和力增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)于Fe3+、金屬離子螯合劑、還原劑以及變性劑等的耐受力也有增強(qiáng)，穩(wěn)定性大大提高。

重組人陰離子型胰蛋白酶；點(diǎn)突變；R 122 L；穩(wěn)定性

胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是一種絲氨酸蛋白酶，由胰腺分泌的胰蛋白酶原激活產(chǎn)生，能專(zhuān)一性的水解精氨酸和賴(lài)氨酸羧基端的肽鍵，同時(shí)也能切割自身精氨酸或賴(lài)氨酸位點(diǎn)而導(dǎo)致自身降解（autolysis）[1]。目前，胰蛋白酶有2個(gè)已知的形式：β-trypsin（23463 Da）和 α-trypsin（23481 Da）。由于肽鍵發(fā)生水解，α-trypsin比β-trypsin多了18 Da[2]。在牛源胰蛋白酶中，β-trypsin可以在Arg 122-Val 123、Lys 148-Ser 149和Lys 162-Ala 163之間的肽鍵發(fā)生水解導(dǎo)致3種可能的α-trypsin亞型。人源胰蛋白酶和牛源胰蛋白酶具有很高的同源性，但在148位點(diǎn)人源胰蛋白酶為Ala，在162位點(diǎn)為Asp[3]。所以Arg 122是人胰蛋白酶-2最重要的自溶位點(diǎn)。已有報(bào)道，遺傳性胰腺炎病人體內(nèi)的胰蛋白酶原-1在Arg 122部位突變?yōu)镠is 122，能抵抗自身降解失活，因此導(dǎo)致胰腺組織的自身消化[4]。另有文獻(xiàn)報(bào)道將鼠源胰蛋白酶該位點(diǎn)突變?yōu)長(zhǎng)eu能顯著提高胰酶的半衰期，并且維持較高的催化活性[5]。我們考慮在該位置引入突變R 122 L，封閉其自溶位點(diǎn)，減少自水解的發(fā)生，從而提高胰蛋白酶的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌株與表達(dá)質(zhì)粒 E.coli BL 21（DE 3）、人源陰離子型胰蛋白酶突變體質(zhì)粒[mhT 2（R 122 L）]質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器和試劑 FE-20 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器公司）；AB 104-N分析天平（梅特勒-托利多儀器公司）；T6紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；JM-250型電泳儀（大連捷邁科建有限公司）；VDS凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技公司）；BAEE，（Sigma）；重組人胰蛋白酶hT 2，購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 mhT 2（R 122 L）突變體的制備[6]將mhT 2（R 122 L）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL 21（DE 3）中，涂板過(guò)夜后挑取單菌落于37℃，180 r/min在添加有50 μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)加入0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，取出一定量的菌液稀釋至OD 600為1.0，吸取1 mL進(jìn)行SDS-PAGE分析。3000 r/min，20 min離心收集其余菌體。

把收集到的菌體用50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl按1∶15（m/v）充分懸浮起來(lái)，超聲破碎，然后12000 r/min離心10 min，棄去上清。沉淀包涵體第1次用0.5% Triton X-100溶液，50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液充分洗滌，然后12000 r/min離心 10 min；第 2次用含有 2 mol/L Urea，50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液充分洗滌，然后12000 r/min離心10 min；第3次用去離子水再洗1次，然后12000 r/min離心10 min；收集包涵體[7]。將初次純化的包涵體進(jìn)行常規(guī)復(fù)性[8-9]。采用CM-FF陽(yáng)離子型交換柱對(duì)復(fù)性液進(jìn)行純化，準(zhǔn)備好2 cm×15 cm層析柱，裝入適量體積的CM陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用pH 5.0緩沖液平衡至基線(xiàn)，用含0～0.25 mol/L NaCl的緩沖液連續(xù)梯度式洗脫，并收集目的峰的流出液。

1.3.2 hT2與mhT 2（R 122 L）的最適pH及pH穩(wěn)定性 最適pH：配制pH為3～12的底物BAEE，分別測(cè)定hT及mhT 2（R 122 L）純酶液的活性，結(jié)果表示為測(cè)定值占最高酶活的百分比。緩沖液依次為NaAc-HAc（pH 3～6），Tris-HCl（pH 7～8），Gly-NaOH（pH 9～11），所有緩沖液均25℃配制。

pH穩(wěn)定性：取hT2及mhT 2（R 122 L）純酶液，分別在pH 3～pH 11緩沖液中稀釋10倍，于25℃下溫育2 h，取樣按常規(guī)方法測(cè)定酶活，以水浴前酶液的初始活性作為100%，計(jì)算殘余率。緩沖液依次為NaAc-HAc（pH 3～6），Tris-HCl（pH 7～8），Gly-NaOH（pH 9～11），所有緩沖液均25℃配制。

1.3.3 hT2與mhT 2（R 122 L）的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 最適溫度：將底物 BAEE分別置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃水浴中溫育30min，加入hT2及mhT 2（R 122L）純酶液測(cè)定活力，結(jié)果表示為OD253nm隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)。

溫度穩(wěn)定性：取hT2及mhT 2（R 122 L）純酶液，分別置于 4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴中溫育 2 h，每隔10 min取樣，按常規(guī)方法測(cè)定酶活性，以水浴前酶液的初始活性作為100%計(jì)算殘余率。

1.3.4 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)hT2與mhT 2（R 122 L）活性的影響 在pH 3和pH 7.6的條件下分別向hT2和mhT 2（R 122 L）純酶液中分別加入1 mmol/L的不同金屬離子（Zn2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+）及 1%的 EDTA（乙二胺四乙酸），PMSF（苯甲基磺酰氟），DTT（二巰基蘇糖醇），SDS（十二烷基硫酸鈉），Triton X-100，4℃保溫24 h后測(cè)活性。

1.3.5 Km值的測(cè)定 以BAEE為底物，測(cè)定mhT 2（R 122 L）和hT2的米氏常數(shù)Km。底物BAEE的濃度范圍為0.005～0.25 mmol/L，用雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度的倒數(shù)值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率即活性的倒數(shù)值為縱坐標(biāo)做圖，與X軸交點(diǎn)的負(fù)倒數(shù)即為Km。

2 結(jié)果

2.1 mhT 2（R 122 L）突變體的制備 經(jīng)15%的SDS-PAGE分析表明，誘導(dǎo)后mhT 2（R 122 L）的位置在大于29 kDa處有明顯的表達(dá)（見(jiàn)圖1），破菌處理后，沉淀中可見(jiàn)大量表達(dá)，上清中基本沒(méi)有目的條帶?？梢?jiàn)mhT 2（R 122 L）是以包涵體的形式表達(dá)。

圖1 mhT 2（R 122 L）蛋白電泳表達(dá)圖M. Marker；1. 誘導(dǎo)前；2. 誘導(dǎo)后；3. 超聲破碎后上清；4. 超聲破碎后沉淀Fig.1 Identification of recombinant mhT 2(R 122 L) based on the SDS-PAGE analysisM. Marker；1. contrast；2. induced；3. Supernatant after ultrasonication；4. Sediment after ultrasonication

重組mhT 2（R122 L）包涵體稀釋復(fù)性后，酶原經(jīng)激活得到活性 mhT 2（R122 L），用 20 mmol/L NaAc-HAc pH 5.0 透析，低溫上柱，經(jīng)過(guò)CM-FF離子交換層析純化獲得比活力為12000 U/mg的mhT 2（R122 L）純酶液，洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2 CM-FF色譜純化mhT 2（R 122 L）Fig.2 CM-FF chromatography of mhT 2（R 122 L）

2.2 hT2與mhT 2（R 122 L）的最適pH及pH穩(wěn)定性 在pH 3～pH 12范圍內(nèi)分別測(cè)定hT2和mhT 2（R 122 L）的活性結(jié)果見(jiàn)圖3，mhT 2（R 122 L）的最適pH范圍增大，在pH 7～11之間酶的催化活力都很好，其中pH 10底物條件下測(cè)得的活性值最高，而pH≤5和pH≥12條件下，mhT 2（R 122 L）基本沒(méi)有催化活性。而與hT2相比較，mhT 2（R 122 L）在pH 5和pH 6條件下催化活力都明顯高于hT 2，說(shuō)明該突變體對(duì)酸的耐受力要明顯強(qiáng)于hT 2。

圖3 hT2和mhT 2（R 122 L）的最適pH測(cè)定Fig.3 Measurement of optimal pH of recombinant hT 2 and mhT 2(R 122 L)

將酶液放置在25℃不同pH環(huán)境中溫浴2 h后，檢測(cè)其殘余酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)造成蛋白的嚴(yán)重失活；在pH 3～6范圍內(nèi)，酶活殘余率都保持在80%以上，而在pH7以上，隨著pH的升高，酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，更加說(shuō)明mhT 2（R 122 L）對(duì)堿的耐受性不強(qiáng)。其中pH 5.0是mhT 2（R 122 L）相對(duì)最為穩(wěn)定的pH條件。與hT2相對(duì)照，整體趨勢(shì)沒(méi)有太大變化，只是hT 2 pH越低越穩(wěn)定，而mhT 2（R 122 L）在pH 3～5之間穩(wěn)定性則相差不大。

圖4 hT2和mhT 2（R 122 L）的pH穩(wěn)定性Fig.4 Stability of recombinant hT 2 and mhT 2(R 122 L)in different pH buffer

2.3 hT 2與mhT 2（R 122L）的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 將底物分別置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中，加入hT2和mhT 2（R 122 L）純酶液測(cè)活，結(jié)果表示為OD 253 nm隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)。圖5顯示，溫度越高，測(cè)得每分鐘吸光度的變化值也就越高。mhT 2（R 122 L）在80℃時(shí)酶反應(yīng)速率最快，并且在5 min內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相比之下，比野生型更為耐熱。

圖5 hT2和mhT 2（R 122 L）的最適溫度測(cè)定Fig.5 Mensurement of optimal temperature of hT 2 and mhT 2(R 122 L)

如圖6所示：4℃條件下胰蛋白酶相對(duì)最為穩(wěn)定，2 h內(nèi)酶活幾乎不損失；25℃溫育2h后尚能殘余80.3%酶活；而與hT2相同的是，隨溫度的升高，胰蛋白酶分子的降解速率也隨之加快，mhT 2（R 122 L）酶活殘余率也逐漸降低；40℃條件下2h內(nèi)酶活殘余僅35.5%。與hT2相比，突變體mhT 2（R 122 L）在60℃溫育20 min完全失活，其熱穩(wěn)定性略高于hT 2（10 min內(nèi)即完全失活），耐熱性能優(yōu)于hT 2。

圖6 hT2和mhT 2（R 122 L）的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Stability of hT 2 and mhT 2(R 122 L) under different temperature

2.4 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)hT2與mhT 2（R 122 L）活性的影響 如表1所示。其中pH 7.6條件下，添加Ba2+、Ca2+、Co2+有利于維持酶活的相對(duì)穩(wěn)定，24 h后殘余酶活達(dá)95%以上；但是加入重金屬離子Fe3+，就會(huì)使酶迅速沉淀而逐漸喪失活性。加入SDS后hT2很快失活，而突變型hT 2（R 122 L）卻在24 h后仍能殘余50%左右的酶活；加入金屬離子螯合劑（EDTA）和還原劑（β-ME）后酶蛋白在2 h后酶活維持在75%以上；加入0.1 mmol/L PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）24 h后酶活殘余90%。

表1 金屬離子及其他試劑對(duì)hT2及mhT 2（R 122 L）酶活的影響Tab.1 The in fl uence of metal ions and some reagents on enzyme activities of hT 2 and mhT 2(R 122 L)

pH3 條件下在酶液中加入 1 mmol/L Ba2+，Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，F(xiàn)e3+等各種金屬離子，孵育 24 h后酶活僅僅損失了不到10%。

2.5 Km值的測(cè)定 將米氏方程式等號(hào)兩邊取倒數(shù)，以1/v對(duì)1/[S]作圖得一直線(xiàn)，其斜率是Km/V，在縱軸上的截距為1/V，橫軸上的截距為-1/Km。依據(jù)圖7求得hT2突變體R 122 L對(duì)底物BAEE的Km值為0.010 mmol/L，Vmax為 2500 μmol/min。hT2突變體 R 122 L與其 hT 2（Km 值為0.015 mmol/L）相比較，其Km值偏小，說(shuō)明突變體與底物BAEE的結(jié)合率比hT2與底物BAEE的結(jié)合率強(qiáng)。

圖7 hT2和mhT 2（R 122 L）的Km值測(cè)定v：反應(yīng)速度；[S]：底物濃度；反應(yīng)條件：25 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.6，0.1 M NaCl，0.01 mol CaCl 2；溫度，25℃Fig.7 Determination of Km of hT 2 and mhT 2(R 122 L)v：the reaction rate； [S]：the concentration of substrate； reaction conditions：25 mmol/L Tris-HCl buffer， pH 7.6， 0.1 M NaCl， 0.01 mol CaCl 2；temperature， 25℃

3 討論

非還原凝膠電泳，也稱(chēng)為天然凝膠電泳。在凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶電荷及分子大小[7]。如圖8所示：mhT 2（R 122 L）基本上只有一條主帶，并且該條帶遷移速率較快；而

hT2樣品在此條帶位置之上，還有一條遷移速率較慢的電泳條帶，從條帶亮度上看含量小于主帶。hT2有α和β兩種構(gòu)型之分，hT2最主要的自消化位點(diǎn)Arg 122-Val 123，會(huì)自我識(shí)別并切割A(yù)rg羧基端的肽鍵而降解成兩條肽段heavy chain（Val 123-Ser 247）和 light chain（Ile 24-Arg 122）[10]。如圖 8所示：在hT2中，有部分蛋白發(fā)生了水解而形成了的α-胰蛋白酶，從電泳圖上來(lái)看，α-胰蛋白酶遷移速率會(huì)比較慢，雖然具有與β-胰蛋白酶相似的活性，但是由于含有自溶位點(diǎn)，相比于β-胰蛋白酶更容易降解而失活[11]。突變體R 122 L將該位點(diǎn)的精氨酸突變?yōu)榱涟彼?，使得該位點(diǎn)不再被胰蛋白酶識(shí)別和切割，遏制了β-胰蛋白酶轉(zhuǎn)化成α-胰蛋白酶的過(guò)程，大大的減少了胰蛋白酶的自我消化和降解，提高了其穩(wěn)定性，相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等也都有了一定的改變[12]。

圖8 mhT 2(R 122 L)和hT2的非還原電泳圖Fig.8 Identification of hT 2 and mhT 2(R 122 L) based on the native SDS-PAGE analysis

野生型的Arg 122位點(diǎn)是堿性氨基酸，氨基酸側(cè)鏈較長(zhǎng)，位于胰蛋白酶分子表面Autolysis loop（見(jiàn)圖9a），并且該位點(diǎn)同時(shí)帶有胰蛋白酶分子所能特異性識(shí)別并進(jìn)行切割的Arg，從而易于發(fā)生水解而斷裂。Arg 122位突變?yōu)長(zhǎng)eu后（見(jiàn)圖9b），由堿性氨基酸變成了非極性的脂肪族氨基酸，側(cè)鏈相對(duì)較短，最重要的是不再是胰蛋白酶的自消化位點(diǎn)，穩(wěn)定性自然增強(qiáng)[13]。

圖9 hT2和mhT 2（R 122 L）三維結(jié)構(gòu)Fig 9 Three-dimensional structure of hT 2 and mhT 2（R 122 L）

mhT 2（R 122 L）突變體蛋白相比于hT2野生型最適pH范圍增大，能夠耐受極酸環(huán)境，耐熱性能也有所提高，與底物BAEE的親和力增強(qiáng)，特別是加入重金屬Fe3+，變性劑SDS，還原劑β-ME，抑制劑PMSF等試劑對(duì)胰蛋白酶的影響也都大幅減弱，穩(wěn)定性大大提高。

人胰蛋白酶的突變對(duì)先天性胰腺炎及遺傳性胰腺炎的影響重大[14]。近年來(lái)不斷有新的報(bào)道指出胰蛋白酶的基因突變是導(dǎo)致胰腺炎及相關(guān)疾病的元兇[15]。針對(duì)于不同的突變體，我們可以從酶學(xué)性質(zhì)上對(duì)其進(jìn)行比較，從蛋白結(jié)構(gòu)上對(duì)找到突變對(duì)于酶學(xué)性質(zhì)改變的影響，這無(wú)論是對(duì)于治療胰腺炎及相關(guān)疾病，還是對(duì)于重組胰蛋白酶進(jìn)行定向改造都是有著很好的借鑒意義。本研究中，我們通過(guò)性質(zhì)的比較闡明了R 122位點(diǎn)對(duì)于hT2穩(wěn)定性的影響，從減少自降解的角度提高了hT2的穩(wěn)定性。但對(duì)于R 122 L突變體在與其它蛋白酶相互作用及應(yīng)用上的研究還需進(jìn)一步深入。

[1] YamashinaI．The action of enterokinase on trypsinogen[J]．Acta．Chem．Scand,1956,20(2)：739-743．

[2] Walsh KA．Trypsinogens and trypsins of various species[J]．Methods Enzymol,1970,19(1)：41-63．

[3] Szabó A,Sahin-Tóth M．Determinants of chymotrypsin C cleavage specificity in the calcium-binding loop of human cationic trypsinogen[J]．FEBS J,2012,279(23)：4283-4292．

[4] James T,Ronald CR．Human TrypsinIsolation and Physical-ChemicalCharacterization[J]．Biochemistry,1969,8(7)：2884-2889．

[5] XinFL,Xin N,Jian GT．Anti-autolysis of Trypsin by Modification of Autolytic Site Arg 117[J]．Biochemical and biophysical research communicatio ns,1998,250(2)：235-239．

[6] 朱乃碩，涂艷，歐西軍．重組人胰蛋白酶原2表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其單克隆抗體的制備和應(yīng)用[P]．中國(guó)：CN200410099275．1，2004：12-29．

[7] 汪家政，范明．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M]．北京科學(xué)出版社，2002：42-47

[8] 王亞輝，愛(ài)潔，李素霞，等．包涵體蛋白質(zhì)的品質(zhì)[J]．生命的化學(xué)，2009，4（29）：609-612．

[9] 張曉彥，李素霞，顧俊杰，等．重組羧肽酶原B的體外變復(fù)性研究[J]．分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，4（10）：124-129．

[10] Miklos ST,Miklos T．Gain-of-function mutation associated with hereditary pancreatitis enhance autoaction of human cationic Trypsingen[J]．Biochem Biophys Res Commun,2000,278(2)：286-289．

[11] Naohiko K,Hidetaro Y,Yoji N,et al．Identification of one- and two-chain forms of trypsinogen 1 produced by a human gastric adenocarcinoma cell line[J]．Biochem,1994,303(1)：187-190．

[12] Steven JP,Michael B,Michael NL．Comparison of Various Molecular Forms of Bovine Trypsin：Correlation of Infrared Spectra with X-ray Crystal Structures[J]．Biochemistry,1991,30(1)：133-143．

[13] Szabó A,Sahin-Tóth M．Increased activation of hereditary pancreatitisassociated human cationic trypsinogen mutants in presence of chymotrypsinC[J]．J Biol Chem,2012,287(24)：20701-20710．

[14] Schnúr A,Beer S,Witt H,et al．Functional effects of 13 rare PRSS 1 variants presumed to cause chronic pancreatitis[J]．Gut,2014,63(2)：337-343．

[15] Sultan M,Werlin S,Venkatasubramani N．Genetic prevalence and characteristics in children with recurrent pancreatitis[J]．J Pediatr Gastroenterol Nutr,2012,54(5)：645-650．

The research of site R 122 L mutate improve the stability of recombinant human anionic trypsin

MA Qiang，WU Qian，LI Su-xiaΔ
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

ObjectiveThe stability and other characteristics of the active recombinant human anionic trypsin(hT 2) with site-mutation R 122 L(mhT 2) were investigated.MethodsAn active human anionic trypsin and its R 122 L mutate were produced with E.coli BL 21(DE 3) and purified with ion-exchange chromatography. The properties of mutant were studied and compared with the wild type.ResultsThe optimal pH for mhT 2 was 7～11. mhT 2 was active over a broad temperature range (4℃～80℃) and owned a little better thermal stability than the wild type. The inhibition of typical metal chelating agent(EDTA), Fe3+, denaturant, reducer(β-ME) on activity of mhT 2 was the same as the wild type. Michaelis constant Km of mhT 2 was 0.010 mmol/L with BAEE as a substrate, a little lower than wild type.ConclusionCompared with the wild type, the R 122 L site mutate significantly enhanced tolerance to acidic pH、denaturants、reductions and autolysis.

recombinant human anionic trypsin; site-directed mutagenesis; R 122 L; stability

R 394．3

A

1005-1678(2014)02-0061-05

馬強(qiáng)，男，碩士，研究方向：分子生物學(xué)，E-mail：maqiang 79 fox@163.com；李素霞，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：分子生物學(xué)，E-mail：lisuxia@ecust.edu.cn。