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        補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞生長周期作用的影響

        2014-09-18 05:56:38井歡唐瑩于丹劉春英
        中國生化藥物雜志 2014年2期
        關鍵詞:益氣湯含藥懸液

        井歡,唐瑩,于丹,劉春英 Δ

        (1. 遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院 病理教研室,遼寧 沈陽 110032;2. 遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院 人體解剖教研室,遼寧 沈陽 110032)

        補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞生長周期作用的影響

        井歡1,唐瑩2,于丹1,劉春英1Δ

        (1. 遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院 病理教研室,遼寧 沈陽 110032;2. 遼寧中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院 人體解剖教研室,遼寧 沈陽 110032)

        目的評估補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞生長周期的影響效果。方法體外培養(yǎng)人肺腺癌A549/DDP細胞,實驗分組為:空白對照組,補中益氣湯組和脾細胞處理組。用不同濃度的補中益氣湯含藥血清和脾細胞刺激A549/DDP細胞,采用MTT法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)測定2種方法對細胞的直接殺傷作用;流式細胞術檢測2種方法對細胞凋亡的影響;熒光顯微鏡觀察2種方法對凋亡小體產(chǎn)生的影響。結果MTT法顯示同空白對照組相比,補中益氣湯含藥血清對細胞生長均有抑制作用(P<0.05),且該法同脾細胞作用后效果類似;2種方法處理后,流式細胞術均可見特征性的細胞凋亡峰;在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞。結論補中益氣湯含藥血清在體外能阻滯A 549/DDP細胞的生長增殖,誘導該細胞發(fā)生凋亡,且效果同脾細胞類似。

        補中益氣湯;A 549/DDP細胞;細胞周期;細胞凋亡

        1.2 主要實驗設備 低溫超速離心機(OTD55B,DUPONT/SORVALL,美國);流式細胞儀(FACScan, BECTON DICKINSON,美國);Milli-Qsp REAGENT Water System(美國);倒置顯微鏡(JMS,NIKON,日本);流式細胞儀(FACScan,BECTON DICKINSON,美國)。

        2 方法

        2.1 A549/DDP細胞的體外培養(yǎng)與傳代 每2~3 d更換一次培養(yǎng)基。肉眼觀察培養(yǎng)液顏色,若由紅色轉為黃色,倒置顯微鏡觀察細胞生長至70%~80%融合時,需要傳代:棄去培養(yǎng)基,加0.25%Trypsin 500 uL,37℃消化3 min后,加5 mL培養(yǎng)基輕輕吹打瓶壁上的細胞使其均勻脫落,制成單細胞懸液。若發(fā)現(xiàn)細胞懸浮、碎裂或其他污染情況則及時丟棄。

        2.2 含藥血清的制備 將6只SD大鼠隨機分為補中益氣湯組和空白對照組,補中益氣湯組大鼠給與補中益氣湯11.34 g/kg體重,1日2次,空白對照組大鼠給與生理鹽水11.34 g/kg體重,1日2次。連續(xù)給藥處理后3 d,禁食12 h后,再次給藥后麻醉,腹主動脈取血,分離血清后濾膜除菌,分裝,置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 脾細胞的制備 將1只SPF級BALB/c小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后,取脾組織用PBS洗凈,浸泡在含PBS的平皿中,用眼科剪盡可能剪碎組織,吸去上清液,組織塊轉移入大瓶中加入15 mL消化酶,37℃,30 min,并在磁力攪拌器上攪拌。在不銹鋼網(wǎng)上輕輕研磨,濾液用300目沙網(wǎng)過濾3次,置于DMEM培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)1h后進行試驗。

        2.4 MTT法檢測對細胞直接殺傷作用 取對數(shù)生長期細胞用0.25% Trypsin消化成單細胞懸液,用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度,96孔板分為 3個濃度組,(1×103/mL、1×104/mL、1×105/mL),每組3個平行孔,每孔接種100 μL細胞懸液,置5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育細胞貼壁24 h。最終確定實驗用細胞濃度為1×103/mL。將含藥血清用孔徑0.22 μm的一次性濾器除菌后,每孔中加10 μL溶液,終濃度為25 μg/mL,50 μg/mL,100 μg/mL 及 200 μg/mL 4個梯度,設 3個復孔,對照孔中加等量空白血清。置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。加入10 μLMTT溶液,充分混勻后置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。加入100 μL異丙醇鹽酸溶液,充分混勻后檢測OD450值。取脾細胞懸液,加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清,稀釋成1×103,再將其接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。培養(yǎng)72 h后加入細胞濃度為1×102的A549/DDP肺腺癌細胞,置含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,每孔加10 μL MTT溶液,充分混勻后置于37℃,5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h。加人100 μL異丙醇鹽酸溶液,充分混勻后檢測OD450值。

        2.5 流式細胞術檢測細胞周期 取生長良好的A549/DDP細胞以1×103/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板上,對照組加入10%空白血清,稀釋成1×103/mL,每孔100 μL,補中益氣湯組加入同濃度同體積的補中益氣湯含藥血清;置37℃,5%CO2溫箱培養(yǎng)24 h,用0.25%胰酶消化后,將細胞懸液加入離心管中,離心1000 r/min,5 min,去上清。取健康小鼠脾制成的脾細胞懸液,加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清,稀釋成1×103/mL,接種至6孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。用PBS清洗2次,1000 r/min離心5 min,去上清。將70%乙醇緩慢滴入試管中,邊滴邊搖動試管,使細胞分散、固定,置4℃過夜備檢。上述固定的A549/DDP細胞離心去上清,用PBS清洗2次,1000 r/min離心5min,調(diào)整細胞濃度為1×103/mL。取200 μL單細胞樣品,加200 μL RNase溶液(10 μg/mL),置37℃水浴搖床30 min。將細胞過濾去除聚積成團細胞,加250 μg/mL的碘化吡啶(PI)染液100 μL,置4℃,30 min,用FACScan流式細胞儀進行檢測,結果采集用ModFit 3.0軟件分析。

        2.6 熒光顯微鏡觀察凋亡小體 空白對照組加DMEM培養(yǎng)基及10%空白血清,稀釋成1×103/mL,接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。補中益氣湯組加DMEM培養(yǎng)基及10%補中益氣湯含藥清,稀釋成1×103/mL,接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。脾細胞處理組用脾細胞懸液,加DMEM培養(yǎng)基及10%胎牛血清,稀釋成1×103/mL,接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。取生長良好的A549/DDP細胞以1×103/mL,37℃共同培養(yǎng)48 h,離心棄上清液,細胞4℃固定5 min,用PBS沖洗3遍,加人20 μL PBS和4μL濃度為1 mmol/L的熒光色素Hoechst 33258,混勻后4℃染色10 min。蒸餾水洗片后,用濾紙吸去多余液體。封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

        2.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用EXCEL進行整理,采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,正態(tài)計量資料以“±s”表示,組間比較采用單因素方差分析,定義α=0.05,以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

        3 結果

        3.1 MTT法檢測對細胞的殺傷作用 倒置顯微鏡下觀察,對照組腫瘤細胞增生旺盛,補中益氣湯組及脾細胞處理組細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,培養(yǎng)液中出現(xiàn)部分懸浮細胞(見圖1)。與空白對照組比較補中益氣湯組和脾細胞處理組均有顯著性抑制腫瘤細胞生長的作用(P<0.05)。2種方法抑制作用無顯著性差異(見表 1)。

        圖1 不同處理方法對A549/DDP細胞的殺傷作用Fig.1 Killing Effect of A549/DDP cell by different treatment methods

        表1 補中益氣湯及脾細胞對A549/DDP細胞生長抑制的影響Tab.1 The inhibition effect of A549/DDP cell by Buzhong Yiqi Decoction and spleen cells treatment respectively

        3.2 流式細胞術檢測細胞周期 與空白對照組比較,補中益氣湯組和脾細胞處理組的樣品中均可見特征性的細胞凋亡峰,空白對照組中未見凋亡峰(見圖2)。

        3.3 熒光染色檢測細胞凋亡作用 與空白對照組比較補中益氣湯組及脾細胞處理組熒光顯微鏡下均可見致密濃染的顆粒狀或塊狀熒光的凋亡細胞,空白對照組中未見(見圖3)。

        圖2 不同方法對A 549/DDP肺癌細胞凋亡的影響Fig.2 Apoptosis of A 549 lung cancer cells by different methods treatment

        圖3 不同方法對A549肺癌細胞凋亡小體的影響Fig.3 Effect of different methods on apoptotic bodies of A549 lung cancer cells by fluorescence microscopy

        4 結論

        隨著細胞生物學及分子生物學的發(fā)展,人們認識到細胞周期的紊亂不僅會產(chǎn)生多種疾病,而且與腫瘤等疾病的發(fā)生均有密切關系[4-5]。80年代以來,西方科學家對中藥研究產(chǎn)生了濃厚的興趣;至今已相繼報道了100多種具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、等多種生理活性的中藥[6-8];有的已在臨床用于腫瘤、肝炎、心血管等疾病的輔助治療和康復,其中最重要的藥理作用當推免疫促進作用。已有的大量藥理和臨床應用表明,這些功能確切的物質(zhì),其原生藥大多屬于補益類中藥[9-10]。補中益氣湯作為補益劑的代表經(jīng)典方之一,健脾益氣,扶正祛邪,具有良好的臨床實際效果,從而引起人們廣泛的重視。由于化學成分、結構及作用機制不明,導致目前應用的中藥制劑多為粗制劑,在分子水平上闡明藥理作用的努力受到限制,因此加強這方面的研究非常必要[11-13]。研究證明:脾細胞對腫瘤細胞具有殺傷作用并能誘導凋亡[14-15]。本實驗創(chuàng)新使用毒副作用小的補中益氣湯為研究對象,從細胞周期角度進行研究,將結果同正常小鼠脾細胞作用后結果進行比較分析。實驗結果表明:補中益氣湯含藥血清對體外培養(yǎng)的A549/DDP人肺腺癌腫瘤細胞具有抑制作用,該效果同脾細胞處理后效果類似。MTT顯示出其具有抗腫瘤作用,流式細胞儀分析結果顯示:補中益氣湯含藥血清可使腫瘤細胞增殖下降,細胞凋亡率增加,提示該方可能通過調(diào)節(jié)免疫功能來抑制腫瘤細胞增殖及促進細胞凋亡。免疫熒光亦提示:補中益氣湯含藥血清與脾細胞脾細胞均可誘導腫瘤細胞的凋亡,出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征。綜上所述,補中益氣湯含藥血清在體外能阻滯A549/DDP細胞的生長增殖,誘導該細胞發(fā)生凋亡,且效果同脾細胞類似,具體機制及相關信號傳遞過程需在今后的研究中深入探討。

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        Effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A 549/DDP cell

        JING Huan1,TANG Ying2,YU Dan1, LIU Chun-ying1Δ

        (1.Department of Pathology, College of Basic Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032,China;2.Department of Human Anatomy, College of Basic Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032 ,China)

        ObjectiveTo study the effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A549/DDP cell.MethodsA549/DDP cells and splenocytes cells were cultured in vitro and divided randomly into three groups: control group, Buzhong Yiqi Decoction group and splenocyte group.A 549/DDP cells were stimulated by different concentrations of Buzhong Yiqi Decoction serum and spleen cells, the direct killing effect on cells were measured by MTT method, cell apoptosis were detected by flow cytometric analysis and the apoptotic body were observed by immunofluorescence method.ResultsMTT results showed that cell growth were inhibited by Buzhong Yiqi Decoction serum in contrast with control groups, and the effect was same as spleen cells, and both treated groups had similar effects. Marked apoptotic peak and the apoptotic body were seen by flow cytometric analysis and fluorescence microscope in both two groups.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction could inhibit the proliferation of A549/DDP cells in vitro and induced cell apoptosis, which is the similar as spleen cells.

        Buzhong Yiqi Decoction;A549/DDP cell;cell cycle;apoptosis

        R 734.2

        A

        1005-1678(2014)02-0048-03

        據(jù)WHO統(tǒng)計,目前全世界肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1],嚴重影響人類健康。應用化學藥物治療雖是臨床主要方法,但隨之而來的不良反應(如頭暈、嘔吐、厭食、無力等),常導致化療失敗[2]。補中益氣湯出自金代名醫(yī)李東垣《脾胃論》,為經(jīng)典復方。由于肺癌細胞對凋亡信號的調(diào)控不敏感,導致生存期延長,凋亡速度低于增殖速度[3],從而導致疾病向惡性情況發(fā)展。本實驗主要觀察補中益氣湯含藥血清對A549/DDP細胞的增殖及凋亡影響,并采用脾細胞作為陽性對照因素,旨在研究該復方抗腫瘤的機制,現(xiàn)報道如下。

        1 材料

        1.1 主要材料 A549/DDP細胞株均購自中國醫(yī)學院腫瘤研究中心;胎牛血清、胰蛋白酶消化液、DMEM培養(yǎng)基及多聚賴氨酸均購自武漢博士德生物工程有限公司;補中益氣湯藥材購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)學院;SD大鼠(體重180~200 g)、SPF級BALB/c小鼠(體重10~12 g),購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:scxk(京)2011-0011。

        遼寧省自然基金資助項目(20102145)

        井歡,女,副教授,碩士生導師,研究方向:中藥免疫調(diào)節(jié)與中藥抗腫瘤,E-mail:2974907780@qq.com;劉春英,通信作者,女,教授,博士生導師,研究方向:中藥抗腫瘤作用機制研究,E-mail:chunying 99@163.com。

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