宋飛 ，向盈盈 ，張小文Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 肝膽胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安醫(yī)院 口腔科，云南 昆明 650031）

紫杉醇-殼聚糖緩釋膜對膽管成纖維細胞增殖的抑制作用

宋飛1，向盈盈2，張小文1Δ

（1.昆明醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 肝膽胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安醫(yī)院 口腔科，云南 昆明 650031）

目的探討紫杉醇-殼聚糖緩釋膜（PTX-Chitosan Sustain film，PTX-CSF）對膽管成纖維細胞增殖和凋亡的影響。方法采用組織塊法進行成纖維細胞的原代單細胞培養(yǎng)。將實驗分為5組：未處理組，單純PTX處理組（250 nM）和低、中、高殼聚糖PTX緩釋膜處理組（100 nM、250 nM、500 nM）。使用噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法檢測細胞的增殖情況，劃痕實驗檢測紫杉醇對TGF-β1誘導(dǎo)細胞遷移的抑制作用，流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞的凋亡及細胞周期。結(jié)果紫杉醇-殼聚糖緩釋膜能有效抑制膽管成纖維細胞的增殖，具有劑量和時間依賴性。其抑制作明顯強于單純的紫杉醇用藥，且隨著時間的延長，優(yōu)勢逐漸體現(xiàn)。紫杉醇-殼聚糖緩釋膜能有效抑制TGF-β1對膽管成纖維細胞的促遷移作用，較單純PTX組具有更長的時間效應(yīng)。72 h時，紫杉醇-殼聚糖緩釋膜組成纖維細胞的凋亡率顯著高于單純PTX組和對照組（P＜0．05），后2者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。72 h時，紫杉醇-緩釋膜組和單純PTX組的G 2/M期細胞比例均較未處理組顯著增加，2者相比，前者也明顯高于后者，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論紫杉醇-殼聚糖緩釋膜具有較強的細胞毒性作用及明顯的緩釋效果，可以維持較長時間的有效濃度，從而較單純紫杉醇用藥更能持續(xù)地抑制膽管成纖維的增殖。

紫杉醇-殼聚糖緩釋膜；膽管成纖維細胞；增殖；細胞凋亡

1 材料與方法

1.1 材料 PRIM 1640培養(yǎng)基（hyclone公司，貨號：11875-093），胎牛血清（Gibco公司，貨號：10099141），胰酶-EDTA消化液（Gibco公司，貨號：25200-056），二甲基亞砜（sigma公司，貨號：D-2650），PTX(重慶美聯(lián)制藥有限公司，貨號：G 0411003)，細胞凋亡及周期檢測試劑盒（南京凱基生物，貨號：KGA 107)。紫杉醇-N-琥珀?；u乙基殼聚糖緩釋膜為本實驗室前期制成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用組織塊法進行成纖維細胞的原代單細胞培養(yǎng)。將手術(shù)切除的組織樣本收入無菌的PRIM 1640培養(yǎng)基中，在超凈臺上清除其他組織，將組織塊剪碎為1 mm3的小塊，接種于培養(yǎng)瓶的底部，加入3 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，放入37℃水浴中消化25 min，消化完畢后加入等量含10%FBS的PRIM 1640培養(yǎng)基內(nèi)終止消化。濾去組織塊后，吸取濾液入離心管800 r/min離心5 min，棄上清。再用培養(yǎng)基重懸細胞懸液，移至培養(yǎng)瓶，均勻鋪滿瓶底后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后出現(xiàn)梭狀成纖維細胞，待細胞爬滿瓶底后，用0.25%的胰酶EDTA消化液進行消化傳代。取3～4代細胞使用。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 實驗分為5組：未處理組、單純PTX處理組（250 nM）和低、中、高殼聚糖PTX緩釋膜處理組（100 nM、250 nM、500 nM）。取對數(shù)生長期5×103個/mL的細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，按照實驗分組，加入相應(yīng)濃度的藥物進行干預(yù)。每組設(shè)6個復(fù)孔，每板設(shè)空白對照。培養(yǎng)1～5 d，每隔24 h取板進行MTT比色法檢測。測定每孔492 nm處的吸光度值，計算成纖維細胞的增殖抑制率[（對照組-實驗組）/對照組×100%]。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕法觀察細胞遷移 實驗分為4組，未處理組，TGF-β1處理組（5 nM），單純PX處理組（250 nM）和PTX殼聚糖緩釋膜處理組（250 nM）。取對數(shù)生長期2×105個/mL的細胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合度＞90%時，垂直于孔背面的橫線劃痕標記，按實驗分組分別于各組對應(yīng)的孔內(nèi)加入1mL含相應(yīng)濃度藥物的10%FBS PRIM 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 0 h、24 h、48 h、72 h 隨機選取視野進行拍照觀察。

1.2.4 流式細胞儀檢測 實驗分為4組，未處理組，TGF-β1處理組，單純PX處理組（250 nM）和PTX殼聚糖緩釋膜處理組（250 nM）。取對數(shù)生長期2×105個/mL的成纖維細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，按實驗分組分別加入相應(yīng)濃度的藥物進行干預(yù)。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～3 d，每隔24 h收集1次細胞，用無菌PBS離心洗滌3次，調(diào)整細胞懸液濃度為1×106個/mL，取195 uL細胞懸液，加入5uL Annexin V-FITC混合，室溫下反應(yīng)10 min，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，細胞沉淀用PBS洗1次，再離心，細胞沉淀重懸于190 uL稀釋緩沖液中，加入濃度為20 ug/mL的碘化丙丁10 uL，反應(yīng)10 min后，采用流式細胞儀對樣品進行檢測。實驗重復(fù)3次、

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0進行分析，正態(tài)計量資料以“±s”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX殼聚糖緩釋膜對成纖維細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示各濃度的PTX殼聚糖緩釋組與單獨PTX處理組對膽管成纖維細胞均具有明顯的抑制作用。PTX殼聚糖緩釋膜對成纖維細胞的增殖抑制具有劑量和時間依賴性。在用藥后24 h，單純PTX處理組的細胞增殖抑制率大于同時間不同載藥濃度的PTX殼聚糖緩釋膜，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。48 h時，PTX殼聚糖緩釋膜組的抑制率繼續(xù)增加，而單純PTX組的抑制率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。到72 h時，單純PTX組中藥物對細胞幾乎無抑制效果，而PTX殼聚糖緩釋膜的抑制仍存在，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）。

圖1 PTX殼聚糖緩釋膜對成纖維細胞增殖的影響

*﹟

2.2 膽管成纖維細胞的遷移情況 劃痕實驗結(jié)果表明，PTX殼聚糖緩釋膜組和單純PTX組均能有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的膽管成纖維細胞的遷移。正常對照組劃痕寬度在24、48、72 h后隨著細胞的增殖劃痕寬度逐漸變小，TGF-β1處理組較正常組寬度變小的幅度更加快速；而單純PTX組有效抑制了TGF-β1引起的這種快速變化，48 h時達到最佳，72 h后寬度又顯著減?。欢鳳TX殼聚糖緩釋膜組在24、48、72 h均能有效抑制膽管成纖維的遷移情況，72 h仍能維持其抑制效果，劃痕寬度明顯大于單純PTX組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 PTX殼聚糖緩釋膜和PTX對膽管成纖維細胞遷移增殖的影響Fig.2 Effect of PTX-CSF and PTX on the proliferation of bile duct fibroblast

2.3 PTX殼聚糖緩釋膜和PTX對膽管成纖維細胞凋亡的影響 利用流式細胞儀對PT殼聚糖緩釋膜和單純PT誘導(dǎo)的膽管成纖維細胞凋亡率進行檢測（見圖3）。其中左上象限為機械性損傷細胞，右上象限為晚期凋亡或壞死細胞，左下象限為陰性正常細胞，右下象限為早期凋亡細胞。流式細胞結(jié)果顯示：單純PTX在250 nM濃度下其凋亡率和正常細胞以及TGF-β1組細胞無顯著性差異，而PTX殼聚糖緩釋膜組的凋亡率較單純PTX組顯著增加（P＜0.05）。在72 h時凋亡率顯著高于同時間的單純PTX組（見圖3）。

圖3 PTX殼聚糖緩釋膜和PTX對膽管成纖維細胞凋亡的影響（72 h）Fig.3 Effect of PTX-CSF and PTX on the apoptosis of bile duct fibroblast (72 h)

2.4 PTX殼聚糖緩釋膜和PTX對膽管成纖維細胞周期的影響 利用流式細胞儀對4組處理的細胞進行細胞周期的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于未處理的膽管成纖維細胞，單純PTX和PTX殼聚糖緩釋膜均能有效地引起G2-M期膽管成纖維細胞的增加，降低G0-G1期細胞的減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖4）。2者進行比較，PTX緩釋膜組較單純PTX組的G2-M期細胞顯著增加，G0-G1期細胞減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 PTX緩釋膜和單純PTX對膽管成纖維細胞周期的影響（72 h）Fig.4 Effect of PTX-CSF and PTX on the cell cycle of bile duct fibroblast (72 h)

3 討論

膽道手術(shù)后的損傷是當今膽道外科所面臨的一個難題，其發(fā)生發(fā)展存在多種因素，其中膽管成纖維細胞的過度活躍是膽管瘢痕或狹窄的主要因素[12]。膽管瘢痕的形成機制目前還尚不明確，但是TGF-β被公認為是可以促進瘢痕形成的重要細胞因子，它主要的作用機制是促進膽管成纖維細胞細胞的異常增殖，抑制其凋亡；促進瘢痕組織中膠原的大量合成；抑制膠原酶合成并增加其組織抑制劑的表達；促進膽管成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并分泌α-SMA，從而導(dǎo)致瘢痕攣縮；激活下游細胞的信號通路因子等[13-15]。

紫杉醇作為一種天然的抗癌藥物已在臨床廣泛應(yīng)用，由于瘢痕組織和腫瘤細胞過度增殖的共同特征，在抑制膽管瘢痕方面也發(fā)揮了重要作用[16]。Choi的研究表明，紫杉醇可以干擾TGF-β1信號通路，從而阻斷膽管上皮細胞和肌成纖維細胞之間的聯(lián)系[17]；Hirose等研究表明低劑量的紫杉醇可以有效抑制TGF-β1引起的膽管癌細胞的增殖。其機制是紫杉醇可以有效阻滯細胞于G2或M期，從而促進細胞死亡[5]。盡管紫杉醇具有良好的抑制瘢痕活性，但是紫杉醇本身的低水溶性給其靜脈給藥帶來很大困難。而在注射劑中采用表面活性劑雖然能增加紫杉醇的水溶性，但也會引起多種副作用導(dǎo)致在對患者用藥本身常常帶來痛苦，因此，如何將紫杉醇安全有效迅速地輸送至損傷處成為研究熱點。目前，已經(jīng)有多種基于納米顆粒所包裝的紫杉醇輸藥系統(tǒng)[6]，但關(guān)于其緩釋膜系統(tǒng)尚未見報道。

本文研制了一種新型的紫杉醇殼聚糖緩釋膜，并從對膽管成纖維細胞的增殖及凋亡兩方面與單純紫杉醇用藥進行了比較。結(jié)果表明紫杉醇殼聚糖緩釋膜和單純PTX均可以有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的膽管成纖維細胞的增殖，其48 h時作用最為明顯，但72 h時單純PTX抑制效果明顯降低，而紫杉醇殼聚糖緩釋膜仍具有明顯抑制效果，數(shù)據(jù)顯示2者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。我們進而對所引起的細胞凋亡進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)在250 nM的用藥濃度下，單純紫杉醇并沒有引起膽管成纖維細胞的顯著凋亡，而紫杉醇殼聚糖緩釋膜反而促進了TGF-β所誘導(dǎo)的成纖維細胞凋亡，進一步檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，無論是單純PTX還是PTX殼聚糖緩釋膜均能引起G 2-M期細胞增多，這說明細胞存在DNA復(fù)制和有絲分裂障礙，這與紫杉醇的作用機制相一致[18]。G 0-G1期細胞減少，而G 2-M期細胞增多，提示了PTX可有效抑制S期DNA合成，使成纖維細胞滯留于G 2-M期。但有趣的是，這一過程中單純PTX并未引起細胞的顯著凋亡，而緩釋膜反而促進了成纖維細胞的凋亡。對于這一現(xiàn)象，我們推測可能是因為紫杉醇對凋亡的效果需要長時間的累積，但目前的研究尚無這方面的報道，這值得我們進行深入研究。

本研究結(jié)果表明，我們研制的紫杉醇殼聚糖緩釋膜能較單純PTX更有效地阻滯膽管成纖維細胞周期，干擾DNA復(fù)制和有絲分裂，進而促進細胞凋亡抑制成纖維細胞的增殖，且隨著時間效果越發(fā)明顯。本研究為臨床上膽管瘢痕或狹窄用藥治療提供了一個新的參考。

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Inhibitation of paclitaxel-chitosan sustain fi lm on biliary fi broblasts cell proliferation

SONG Fei1,XIANG Ying-ying2,ZHANG Xiao-wen1Δ

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101,China;2.Department of Stomatology, The Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650051,China)

ObjectiveTo explore the effect of Paclitaxel-Chitosan Sustain film on growth, apoptosis and cell cycle of biliary fibroblasts cell.MethodsHuman biliary fibroblasts cell were cultured and treated with PTX-CSF and naked PTX,separately, untreated cells as blank control. The experiment was divided into five groups: untreated group, simple PTX-treated group (250nM) and low, medium and high chitosan sustained-release film PTX-treated group (100 nM, 250 nM, 500 nM). The proliferations of cells were determined by MTT assay. The apoptosis and cell cycle of cells were detected by FCM.ResultsThe proliferation of biliary fibroblasts cells was inhibited by PTX-CSF with time-dependent and dose-dependent,and the inhibiting effect was more obvious than naked PTX treatment as the time went on. Meanwhile, PTX-CSF could inhibit the magration of bile duct fibroblasts induced by TGF-β 1,and had longer effect than naked PTX. After 72 h, the apoptosis rate of cell treated with PTX-CSF was significantly higher than that treated with naked PTX or untreated cell(P＜0.05), the difference between naked PTX or untreated cells was not significant. Compared with untreated cells, the proportion of G 2/M in cells treated with PTX or PTX-CSF were significantly increased, and the former was sinificantly higher than the latter(P＜0.05).ConclusionCompared with naked PTX, PTX-CSF has strong cytotoxic effects and obviously sustained-release effect. The effective concentration can be maintain for a long time by PTX-CSF, and it could be as the novel drug delivery system to continuously inhibit proliferation of bile duct fibroblasts.

paclitaxel;chitosan sustain film;biliary fibroblasts cells;proliferation;apoptosis

R-33；R 285．5

A

1005-1678(2014)02-0004-04

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是從紅豆杉（Taxusbrevifolia）樹皮中萃取而來的一種熔點為210℃的白色結(jié)晶粉末[1]。目前廣泛應(yīng)用于臨床治療各種癌癥，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等等[2]。有研究表明紫杉醇能有效抑制膽管損傷后膽管瘢痕的形成，其作用機制是PTX可以促進和穩(wěn)定微管，抑制細胞停滯在G2或M期，無法進行正常的有絲分裂從而促使細胞死亡[3-6]。

PTX使用的主要缺陷在于其水溶性極低（＜0.004 mg/mL），因此目前臨床上使用的是商品化PX注射劑——Taxol。PTX被配制在聚氧乙烯化蓖麻油的有機溶劑（聚氧乙烯蓖麻油）和脫水乙醇（50/50，V/V）中。其中的助溶劑聚氧乙烯蓖麻油不良反應(yīng)較大（如血液毒性、神經(jīng)毒性、過敏反應(yīng)等）[7-9]。因此，越來越多的研究致力于改善PTX的水溶性，以使其安全有效迅速運輸至患者體內(nèi)[10]。殼聚糖輸藥系統(tǒng)發(fā)展至今較為成熟，在本研究中，我們采用Dhanikula等[11]的方案研制出不同濃度的PTX-殼聚糖緩釋膜，對比檢測其與單純PTX對膽管成纖維細胞增殖的影響，隨后在轉(zhuǎn)化生長因子β 1（transforming growth factor-β，TGF-β）的誘導(dǎo)下，觀測PTX緩釋膜對膽管成纖維細胞遷移和凋亡的影響，對比研究緩釋膜與單純用藥的差異，為膽管瘢痕臨床用藥新劑型提供理論基礎(chǔ)。

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（81260084）

宋飛，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肝膽胰外科，E-mail：85291753@qq.com；張小文，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：肝膽胰外科，E-mail：283073084@qq.com。