王忠超，李躍華，張彬，劉蘭濤，魏成喜，額都,，任立群

（1. 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 病理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130031；2. 長(zhǎng)春市中醫(yī)院 急診科，吉林 長(zhǎng)春130021 ；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙西醫(yī)結(jié)合藥物研究所，內(nèi)蒙古 通遼 0280072；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007；5. 吉林大學(xué) 藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春1300513）

蒙藥乳腺-I號(hào)對(duì)乳腺增生大鼠乳腺組織細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王忠超1，李躍華2，張彬3，4△，劉蘭濤4，魏成喜3，額都3,4，任立群5

（1. 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 病理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130031；2. 長(zhǎng)春市中醫(yī)院 急診科，吉林 長(zhǎng)春130021 ；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙西醫(yī)結(jié)合藥物研究所，內(nèi)蒙古 通遼 0280072；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007；5. 吉林大學(xué) 藥學(xué)院 實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春1300513）

目的研究蒙藥乳腺-I（M-I）號(hào)對(duì)乳腺增生大鼠乳腺組織細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雌性未孕Wistar大鼠，乳腺增生模型復(fù)制方法為大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·d）25 d，隨后肌肉注射黃體酮4 mg/（kg·d）5 d。實(shí)驗(yàn)共分為6組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組，均給與生理鹽水灌胃;陽(yáng)性藥對(duì)照組，給與三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃;M-I號(hào)低、中和高劑量組分別給予M-I號(hào)0.5 g/kg、1.0 g/kg和3.0 g/kg灌胃。給藥結(jié)束后，通過(guò)對(duì)各組大鼠乳腺組織進(jìn)行HE染色，觀察大鼠乳腺組織增生的程度，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察乳腺組織中增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控因子Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果M-I號(hào)能夠抑制乳腺組織增生，降低PCNA和Bcl-2的表達(dá)活性（P＜0.05），增加Bax的表達(dá)活性（P＜0.05），進(jìn)而抑制乳腺組織細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。結(jié)論M-I號(hào)對(duì)乳腺增生大鼠有較好的治療作用，其治療機(jī)制與抑制大鼠乳腺組織細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。

蒙藥乳腺-I號(hào);乳腺增生;細(xì)胞凋亡

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 雌性Wistar大鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物室提供，數(shù)量為48只，體重在180～220 g之間，大鼠合格證號(hào)為 SCXK-（吉）2007-0003。

苯甲酸雌二醇注射液和黃體酮注射液均購(gòu)買(mǎi)于上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別是090902和090402；枸櫞酸他莫昔芬，批號(hào)090101，購(gòu)買(mǎi)于蘇州第一制藥有限公司；pv-6000通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：133308 A）、DAB顯色試劑盒（批號(hào)：k 136924 F）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：bs-0491 R）、PCNA抗體（批號(hào)：BM 0104）、Bcl-2抗體（批號(hào)：c 2913）、Bax（批號(hào)：c 0212）試劑盒均購(gòu)買(mǎi)于武漢博士德生物工程有限公司。

內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院負(fù)責(zé)提供M-I號(hào)（哲衛(wèi)藥準(zhǔn)字：9604-79），其處方組成包括豆蔻、丁香、梔子、手掌參、沙棘、赤子、珍珠桿、訶子等30味蒙藥。大鼠給藥劑量根據(jù)臨床藥物劑量換算而得。

1.2 分組及給藥 首先隨機(jī)選出8只大鼠作為正常對(duì)照組（NC），將NC大鼠每天肌肉注射生理鹽水，連續(xù)注射30 d，借鑒文獻(xiàn)[5]中的方法將其余大鼠復(fù)制乳腺增生模型，具體措施為給予大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇25 d，劑量為0.5 mg/（kg·d）；再肌肉注射黃體酮5 d，劑量為4 mg/（kg·d），之后將乳腺增生大鼠隨機(jī)分為5組：模型對(duì)照組（MC），給予生理鹽水灌胃；陽(yáng)性藥對(duì)照組（PC），給予三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃；M-I低、中和高劑量組（M-IL、M-IM和M-IH），分別灌胃給予M-I 0.5 g/kg、1.0 g/kg和3.0 g/kg；共給藥4周，期間NC大鼠給予生理鹽水灌胃。給藥期間每天觀察大鼠狀態(tài)，處理動(dòng)物前，動(dòng)物禁食12 h，收集血清分裝于100μL EP管中，－80℃冰箱凍存；取乳腺組織用4%多聚甲醛固定。

1.3 大鼠乳腺組織病理學(xué)檢查 將大鼠乳腺組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下觀察乳腺組織形態(tài)，并對(duì)各組大鼠乳腺增生情況進(jìn)行分級(jí)并記分：正常乳腺形態(tài)，記1分；病理表現(xiàn)為纖維組織在乳腺小葉內(nèi)增多，腺泡和導(dǎo)管擴(kuò)張而且數(shù)量增多，但腺泡及導(dǎo)管上皮無(wú)增生者視為輕度增生，記2分；病理表現(xiàn)為腺泡數(shù)量增多，且腺泡擴(kuò)張及分泌現(xiàn)象嚴(yán)重，腺泡及導(dǎo)管上皮出現(xiàn)多層或乳頭狀改變者視為重度增生，記3分，之后對(duì)各組平均積分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠乳腺組織Bax，Bcl-2，PCNA的表達(dá) Bax，Bcl-2，PCNA采用pv-6000通用型二步法檢測(cè)試劑盒測(cè)定，操作步驟如下：將組織切片進(jìn)行脫蠟和水化；3% H2O2去離子水孵育10 min；滴加一抗后4℃過(guò)夜，用配好的PBS液沖洗3次，每次2 min；滴加試劑1后37℃孵育20 min，PBS 液沖洗3次，每次2 min；滴加試劑2后37℃孵育20 min，PBS液沖洗 3次，每次2 min；應(yīng)用DAB溶液顯色；自來(lái)水充分沖洗后蘇木素復(fù)染。

乳腺組織中PCNA的陽(yáng)性強(qiáng)度判斷方法參照文獻(xiàn)[6]，每個(gè)切片隨機(jī)取3個(gè)視野，觀察每個(gè)視野中的乳腺上皮細(xì)胞，每個(gè)視野中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為（-），陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為（+），陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)10%～50% 為（++），陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為（+++）。Bax，Bcl-2的圖像采用 Motic Images Advanced 3.2軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)總面積占選區(qū)總面積的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，大鼠乳頭高度及乳腺組織Bax，Bcl-2，PCNA表達(dá)量用“x±s”表示。組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 M-I對(duì)模型大鼠乳腺組織PCNA表達(dá)的影響PCNA 在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，染色為棕黃色顆粒。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，PCNA的表達(dá)量有顯著性增加（P＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥、蒙藥乳腺-I號(hào)中、高劑量均可降低增生大鼠乳腺組織中PCNA的表達(dá)量，具有顯著差異（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 各組大鼠乳腺組織PCNA 表達(dá)的比較（n=24）Tab.1 Comparison of PCNA expression in various groups by Immunohistochemical (n=24)

2.2 M-I對(duì)大鼠乳腺組織Bax和Bcl-2表達(dá)的影響 與正常組大鼠比較，模型對(duì)照組大鼠乳腺組織中Bax水平顯著降低，Bcl-2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；M-I號(hào)高劑量組大鼠血清Bax、Bcl-2水平接近于正常對(duì)照組。與模型對(duì)照組大鼠比較，M-I號(hào)高劑量組乳腺組織中Bax水平顯著增高（P＜0.05），Bcl-2水平顯著降低（P＜0.05，見(jiàn)表2、圖1、圖2）。

表2 各組大鼠乳腺組織 Bax、Bcl-2表達(dá)的比較（n=8）Tab.2 Comparison of Bax and Bcl-2 expression in various groups by Immunohistochemical (n=8)

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中Bax的表達(dá)Fig.1 The expression of Bax in various groups by Immunohistochemistry

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中Bcl-2的表達(dá)Fig.2 The expression of Bcl-2 in various groups by Immunohistochemistry

2.4 大鼠乳腺組織病理學(xué)特征分析 HE染色可見(jiàn)NC組大鼠乳房中脂肪較多乳腺小葉數(shù)量較少，呈散在分布，無(wú)導(dǎo)管和腺泡擴(kuò)張及數(shù)量的增多、導(dǎo)管腔和腺泡腔內(nèi)無(wú)分泌物或僅有少許分泌物。與正常組相比，模型對(duì)照組乳腺小葉數(shù)量增多，腺泡及導(dǎo)管大量增生，腺泡高度擴(kuò)張，可見(jiàn)腺泡腔及導(dǎo)管腔內(nèi)有大量分泌物，導(dǎo)管上皮呈多層和/或乳頭狀改變。陽(yáng)性藥對(duì)照組乳腺小葉數(shù)和乳腺小葉腺泡數(shù)比模型對(duì)照組明顯減少，腺泡上皮多呈立方上皮，少數(shù)為扁平狀，腔內(nèi)無(wú)分泌物或有少許分泌。M-I號(hào)各治療組乳腺小葉數(shù)及小葉腺泡數(shù)均少于模型對(duì)照組，乳腺腺泡數(shù)目及腔內(nèi)分泌物較少，導(dǎo)管管腔變小，體積縮?。ㄒ?jiàn)表3）。

表3 各組大鼠乳腺組織病理學(xué)評(píng)分的比較（n=8）Tab.3 Comparisons of pathological grading scores of breast tissue of rats in various group(n=8)

3 討論

目前乳腺增生病的病因并不明確，主要的觀點(diǎn)是認(rèn)為女性在月經(jīng)周期作用下，雌激素反復(fù)作用于乳腺，使乳腺導(dǎo)管和小葉過(guò)度增生最終導(dǎo)致乳腺增生。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡方式之一，和細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞調(diào)亡是細(xì)胞主動(dòng)的、程序性的死亡。有研究表明，在月經(jīng)周期中乳腺細(xì)胞存在著增殖和凋亡的波動(dòng)[7]。增殖活性是主要依賴(lài)性激素的波動(dòng)，而細(xì)胞凋亡活動(dòng)可能受到激素和非激素雙重因素的調(diào)控[8]。因此可推測(cè)乳腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡的穩(wěn)定性對(duì)乳腺正常的形態(tài)和功能有重要的意義，一旦二者平衡被破壞，出現(xiàn)了增殖過(guò)度或者凋亡減退，這樣一來(lái)就會(huì)促進(jìn)乳腺增生癥的形成。以往的研究已表明M-I號(hào)對(duì)乳腺增生癥的治療與調(diào)整大鼠體內(nèi)雌、孕激素水平，調(diào)整大鼠乳腺組織中雌、孕激素受體表達(dá)是有關(guān)的[9]，而M-I號(hào)的作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞中與細(xì)胞增殖與凋亡的因素相關(guān)，本研究利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)大鼠乳腺組織中與細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而對(duì) M-I號(hào)的治療機(jī)制進(jìn)行探討。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員中調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因。Bax是促凋亡基因，而B(niǎo)cl-2能夠抗凋亡，可通過(guò)許多途徑阻止細(xì)胞凋亡。如Bax過(guò)度表達(dá)，Bax 蛋白間會(huì)形成同源二聚體，推動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；如Bcl-2過(guò)度表達(dá)，它會(huì)與Bax蛋白結(jié)合形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡的進(jìn)行[10]。因此二者比例如果不正常，細(xì)胞凋亡將失去重要的調(diào)控因素[11]。Luna-MoréS等對(duì)508例乳腺樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺增生、乳腺原位癌和乳腺轉(zhuǎn)移性癌組織中 Bcl-2表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)[12]。

在本實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠乳腺組織中Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降，表明乳腺增生大鼠體內(nèi)，乳腺增生的發(fā)生與細(xì)胞凋亡減少有關(guān)。與模型對(duì)照組比較，M-I號(hào)高、中劑量組的Bcl-2表達(dá)明顯下降，而B(niǎo)ax含量升高，提示M-I號(hào)在治療乳腺增生的過(guò)程中，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

PCNA不但在細(xì)胞核內(nèi)合成，而且在細(xì)胞核內(nèi)實(shí)現(xiàn)其功能。它能夠?qū)NA的合成與修復(fù)起作用，在細(xì)胞周期的G1期PCNA表達(dá)逐漸增加，S期表達(dá)到高峰，在細(xì)胞周期的G2期和M期PCNA表達(dá)減少，PCNA表達(dá)水平的高低可用來(lái)反映細(xì)胞DNA合成速度。目前已把PCNA作為衡量細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)之一。多項(xiàng)研究表明，PCNA在細(xì)胞內(nèi)含量高時(shí)，細(xì)胞增生活躍，倍增時(shí)間短，細(xì)胞分化程度低，組織侵襲力強(qiáng)，腫瘤的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早，臨床預(yù)后差[13-14]。在乳腺癌的研究方面，許多學(xué)者已把PCNA的陽(yáng)性表達(dá)用來(lái)估計(jì)乳腺癌的預(yù)后情況[15-16]。例如石林祥等對(duì)乳腺癌術(shù)后5年無(wú)復(fù)發(fā)組和死亡組乳腺組織中 PCNA表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果PCNA 高者預(yù)后明顯差于PCNA低者，且PCNA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，PCNA高者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率高，臨床分期晚[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，大鼠乳腺組織PCNA的表達(dá)量有顯著的增加（P＜0.01），與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥、蒙藥乳腺-I號(hào)中、高劑量均可降低增生大鼠乳腺組織中PCNA的表達(dá)量，具有顯著差異（P＜0.05）。

綜上所述，蒙藥乳腺-I號(hào)不僅可以改善乳腺增生大鼠乳腺組織的病理結(jié)構(gòu)，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞中PCNA、Bcl-2 和 Bax的表達(dá)發(fā)揮治療乳腺增生的作用。

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Effect of Mongolian Remedy RuXian- I on proliferation and apoptosis of mammary gland hyperplastic tissue in rats

WANG Zhong-chao1, LI Yue-hua2, ZHANG Bin3,4△, LIU Lan-tao4, WIE Cheng-xi3, E Du3,4, REN Li-qun5
（1. Department of Pharmacology, Changchun Medical College, Changchun 130031, China; 2. Affiliated Hospital Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028007, China; 3. Institute of Mongolia and Western Medicinal treatment, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028007, China; 4. Emergency department,Changchun Chinese medicine hospital, Changchun 130021, China; 5. Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo observe effects of Mongolian Remedy RuXian- I on proliferation and apoptosis of Mammary Gland Hyperplastic Tissue in Rats。Method8 rats randomly chosen from Forty-eight virgin female Wistar rats were regarded as normal. The others were injected intramuscular with E 2(0.5 mg/kg) per day for 25 d and P(4 mg/kg) per day for 5 d. The rats in normal control group were injected with normal saline. Then disease model group was randomly divided into 5 groups: model control group, positive control group, M- I low dosage group, M- I middle dosage group and M-I high dosage group. The rats in different groups were respectively treated with normal saline, tamoxifen, M- I 0.5, 1.0 and 3.0 g/kg for 28 d. Then the pathological changes and expressions of Bax, Bcl-2, PCNA in breast tissues were measured。ResultsCompared with normal control group, expression of PCNA and Bcl-2 in model control group were obviously higher(P＜0.01, P＜0.05), while the expression of Bax were obviously lower (P＜0.01). Compared with model control group, the expressions of PCNA and Bcl-2 in breast tissue in M-I high dosage group were obviously lower, while the expressions of Bax breast tissues were obviously higher(P＜0.05)。ConclusionTreatment mechanism of M-I may be related with inhibited cell proliferation and promote cell apoptosis in the breast tissue.

Mongolian Remedy RuXian-I; hyperplasia of mammary glands; apoptosis

R 285.5

A

1005-1678(2014)01-0056-04

有報(bào)道表明，我國(guó)因乳腺癌死亡的人群平均年齡為67.91歲，其中年齡在 55～75歲的患者已占乳腺癌死亡人數(shù)的46.75%[1]。因此乳腺疾病對(duì)老年人的健康已造成了不可忽視的危害。對(duì)乳腺癌的防治重在早期預(yù)防，而乳腺增生癥是誘發(fā)乳腺癌的因素之一，隨著生活環(huán)境的改變及生活節(jié)奏的加快，其發(fā)病率逐年升高[2]。目前臨床上治療乳腺增生的有效藥物很少，西藥治療又有很大的副作用。蒙藥乳腺-I（M-I）號(hào)經(jīng)臨床驗(yàn)證對(duì)乳腺增生的治療有較好的治療效果。據(jù)臨床療效觀察，其治療乳腺增生的有效率可達(dá)到96.7%[3]。因此深入探討M-I的治療機(jī)制，為開(kāi)發(fā)民族藥及進(jìn)一步研制治療乳腺增生的有效藥物，減少乳腺增生病對(duì)患者造成的病痛有重要的意義。為探討M-I的治療機(jī)制，在前期工作中已利用熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)做了初步研究，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜鑒定出的結(jié)果中，有部分差異蛋白是與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的[4]。因此在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)復(fù)制大鼠乳腺增生模型，利用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)M-I號(hào)作用后大鼠乳腺組織中增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究M-I號(hào)治療乳腺增生癥的治療機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

王忠超，女，博士，講師，研究方向：乳腺病理學(xué)與病理生理學(xué)，Email：jlccwzc@qq.com；張彬，通信作者，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：乳腺外科學(xué)，E-mail:bzh 9911@163.com。