范海波，張海△，李瑩，張園，唐建熹，陳俊匯，李本義

(1.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院 超聲科，廣東 深圳 518020；2.香港大學(xué) 深圳醫(yī)院 放射科，廣東 深圳518020；3.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院 內(nèi)科，廣東 深圳 518020；4.珠海市衛(wèi)生局科技處，廣東 珠海 519000；5.湖北省中山醫(yī)院 外科，湖北 武漢 430033；6.美國堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，堪薩斯州 堪薩斯市 66160)

超聲對納米多聚體靶向釋放D N A影響的實(shí)驗(yàn)性研究

范海波1，張海1△，李瑩2△，張園3，唐建熹4，陳俊匯5，李本義6

(1.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院 超聲科，廣東 深圳 518020；2.香港大學(xué) 深圳醫(yī)院 放射科，廣東 深圳518020；3.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院 內(nèi)科，廣東 深圳 518020；4.珠海市衛(wèi)生局科技處，廣東 珠海 519000；5.湖北省中山醫(yī)院 外科，湖北 武漢 430033；6.美國堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，堪薩斯州 堪薩斯市 66160)

目的通過超聲照射納米多聚體實(shí)驗(yàn)，了解超聲對納米多聚體靶向可控釋放DNA的影響。方法實(shí)驗(yàn)用溶劑蒸干法制備納米多聚體——聚乳酸/乙醇酸共聚物（Polylactic/poly glycolic acid， PLGA），為表面攜帶雄激素受體PLGA納米顆粒，其包裹有編碼熒光蛋白（GFP）的DNA。配制PLGA溶液2 h后，用2種超聲方式，不同占空比及不同時(shí)間輻照后將溶液離心，定量觀察DNA釋放情況及細(xì)胞熒光表達(dá)效果。結(jié)果超聲能破壞PLGA納米殼，并釋放DNA。輻照組的多聚體DNA釋放量均高于對照組；DNA釋放量隨超聲輻照的聲強(qiáng)、時(shí)間增加變化不顯著；連續(xù)超聲波輻照降解作用略強(qiáng)于脈沖波；胰淀粉酶對DNA釋放影響不大。結(jié)論體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲有促進(jìn)PLGA納米多聚體降解及DNA釋放的作用。

超聲降解；納米多聚體；聚乳酸/乙醇酸共聚物；脫氧核糖核酸

1.2 方法 甘露醇干燥保存的PGLA納米粒加PBS稀釋，配制成每樣本500μL數(shù)十份后靜置2 h，在37℃環(huán)境下進(jìn)行超聲輻照試驗(yàn)。第1組是超聲輻照組樣本制作，用脈沖波、50%占空比，分別對制備的PLGA溶液輻照1.5、9、20 min，對照組（不加超聲輻照）。第2組分別以10%、30%、50%的占空比輻照

PLGA溶液9 min。第3組分別用30%占空比和50%占空比、同頻率分別采用連續(xù)波和脈沖波輻照PLGA溶液9 min。第四組設(shè)立無輻照對照組及連續(xù)波和脈沖波輻照組，并將部分輻照后的PLGA溶液分別加2μL的冰醋酸，氫氧化鈉置于不同酸堿環(huán)境或加入胰淀粉酶。以500μL PLGA離心3 min取上清，先予100μL氯仿清除脂溶雜質(zhì)，振蕩30 s，14000 r/min離心機(jī)離心3 min后，取上清抽提基因DNA，以Nanodrop儀定量觀測DNA濃度。對照組：雙蒸水陰性對照。部分采用紫外分光光度計(jì)（uvND-1000 UV spoetrophotometer）驗(yàn)證，方法是：500μL離心后1 mL水離心法沖洗2遍，加入400μL氯仿清除雜質(zhì)，加1 mL TE緩沖液(pH 8.0)提取DNA，UV 260波長測量，并計(jì)算DNA濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 4組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并取其平均值采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SPSS 13.0采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK的方法。

2 結(jié)果

2.1 超聲輻照PLGA靶向釋放DNA定性實(shí)驗(yàn) 在試管中，以超聲輻照含納米粒溶液，大部納米殼破裂，使得溶液上清中DNA含量增加，證實(shí)超聲具有降解PLGA納米粒作用（見圖1）。

圖1 PLGA靶向釋放DNA定性實(shí)驗(yàn)圖1.苯酚提取DNA；2.超聲處理后；3.無超聲處理Fig.1 Degradation of PLGA Released DNA1.Phenol extraction DNA；2.After Ultrasound treatment；3.No Ultrasound treatment

2.2 超聲輻照下胰淀粉酶、酸堿對PLGA納米?？蒯尩年P(guān)系 有無超聲輻照以及胰淀粉酶、酸堿處理后對PLGA納米粒控釋的關(guān)系結(jié)果見圖2。直接超聲組輻照后DNA測值與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。胰淀粉酶組DNA測值與直接超聲組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10%占空比下，pH偏酸性時(shí)PLGA釋放DNA增多，與直接超聲組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；pH偏堿性時(shí)釋放DNA破壞，測值消失。30%占空比下，酸環(huán)境下的數(shù)據(jù)丟失。

2.3 對照組與同強(qiáng)度超聲組輻照時(shí)間與DNA釋放量關(guān)系重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，對照組與同強(qiáng)度超聲組輻照時(shí)間與DNA釋放量關(guān)系結(jié)果見表1。從中可以看出，在有無超聲輻照2組間DNA釋放量有顯著性差異（P＜0.05），說明超聲能促進(jìn)DNA的釋放。但不同輻照時(shí)間的DNA釋放量無明顯差異。

圖2 超聲降解PLGA控釋DNA測定PW1：10%的占空比輻照樣本；PW3：30%的占空比輻照樣本*P＜0.05，與對照組比較Fig.2 Ultrasonic Irradiation on Degradation of PLGA Released DNA PW 1：10% duty cycle irradiation samples；PW 3：30% duty cycle irradiation samples*P＜0.05，compared with control group

表1 DNA釋放量隨對照組和同強(qiáng)度超聲不同輻照時(shí)間組的變化Tab.1 Ultrasonicat ion irradiation time - the release of DNA

2.4 超聲參數(shù)占空比不同與DNA釋放量間的關(guān)系 用不同占空比超聲處理各組，其DNA釋放量間的數(shù)值變化見圖3。超聲輻照強(qiáng)度與DNA釋放量間的關(guān)系（相同時(shí)間）為用不同占空比超聲處理各組后DNA釋放量的變化，超聲各組均選脈沖波，作用時(shí)間均為9 min，結(jié)果顯示：隨占空比增加DNA釋放量增加趨勢不明顯。

圖3 不同占空比與DNA釋放量Fig.3 Different duty cycle and the release of DNA

2.5 超聲脈沖波/連續(xù)波與DNA釋放量間的關(guān)系 用30%占空比，9 min；50%占空比，9 min，同頻同時(shí)間分別采用連續(xù)波和脈沖波處理各組DNA釋放量間的數(shù)值變化見圖4。由圖可知，在占空比、作用時(shí)間相同的情況下，不同超聲發(fā)射波對DNA的釋放量無差異。

圖4 超聲脈沖波/連續(xù)波與DNA釋放量Fig.4 US pluse /continuous wave and the release of DNA

3 討論

乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)在體內(nèi)降解為乳酸單體，作為能量代謝物質(zhì)參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)，終產(chǎn)物為水和二氧化碳，是目前美國FDA批準(zhǔn)可用于臨床的，機(jī)體內(nèi)生物可降解的，無害清除的功能納米多聚體新材料[1]。直徑為納米的微球，特別是100 nm以下的納米粒子，是目前公認(rèn)的攝入效果最好的、具有良好的透過血管內(nèi)皮間隙，通過細(xì)胞吞噬作用，能增加細(xì)胞對核苷酸攝取的并持久停留在靶細(xì)胞內(nèi)、被動(dòng)靶向進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物與基因載體納米粒子[2]。PLGA表面聯(lián)結(jié)的具有腫瘤靶向的基團(tuán)或抗體使得其主動(dòng)附集在腫瘤，選擇殺死腫瘤細(xì)胞[5，6]。這個(gè)研究表明：多聚體降解、基因、藥物釋放除與微球大小、基質(zhì)多聚體材料多孔等材料因素外，在特定時(shí)間使用超聲波輻照，能提高體外模擬狀態(tài)下納米多聚體顆粒降解率與DNA基因釋放。超聲輻照納米溶液靶向釋放DNA定性實(shí)驗(yàn)中用與不用超聲、與苯酚提取DNA三者電泳差異明顯，超聲輻照有局部靶向促納米粒降解、增強(qiáng)基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放的潛能。

超聲微泡靶向控釋技術(shù)（ultrasoun-targeted microbubble destruction，UTMD），是一種靶向、高效有廣闊應(yīng)用潛力的非病毒基因與藥物輸送系統(tǒng)[2，7]。其機(jī)制與超聲通過空化與聲孔、聲流（acoustic streaming）效應(yīng)增加降解有關(guān)[8]。國內(nèi)外近期開始研究含氣多功能納米粒，特別是能發(fā)生諧波共振增大背散射面積的含氣膠粒，它對回波信號(hào)增強(qiáng)明顯，并能在超聲諧振下爆裂、釋放DNA與內(nèi)部藥物，因而持續(xù)受到關(guān)注，很有研究與應(yīng)用前景[2-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超聲體外對納米PLGA多聚體有促進(jìn)生物降解與靶向控釋DNA作用。超聲輻照與否，各組別納米微粒DNA釋放量差異明顯；而超聲波的種類（同聲強(qiáng)、同時(shí)間；不同占空比超聲波；PW與CW、和同占空比延長照射時(shí)間，對轉(zhuǎn)基因納米粒的DNA釋放量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

該研究還表明，超聲安全的靶向觸發(fā)，可控降解、釋放基因同時(shí)受眾多因素影響。外分泌胰淀粉酶組對釋放影響不大；偏堿性pH下，PLGA納米粒釋放DNA少，這是由于PLGA聚合物末端為未封閉的羧基，在生理和偏堿性pH下，導(dǎo)致DNA釋放少、且表面呈負(fù)電荷。這樣當(dāng)其被細(xì)胞內(nèi)攝取后到達(dá)酸性的溶酶體中(pH 4)，納米粒釋放DNA多、表面發(fā)生選擇性的電荷逆轉(zhuǎn)，即由負(fù)電荷轉(zhuǎn)變成正電荷，這一轉(zhuǎn)變有利于納米粒與負(fù)電荷的溶酶體囊泡膜的相互作用，造成瞬間局部的囊泡膜去穩(wěn)定化，納米粒逃逸溶酶體而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用[7]。超聲波具有眾多參數(shù)，而具有開發(fā)靶向治療的潛能，對腫瘤的非侵入靶向藥物與基因治療意義重大。

此研究證實(shí)超聲在體外對納米PLGA多聚體有促進(jìn)生物降解與靶向可控釋DNA作用；超聲輻照下納米PLGA多聚體使DNA在細(xì)胞內(nèi)分布更集中、自然降解無細(xì)胞毒性、穩(wěn)定性能好，是一種基因與藥物傳遞的新方法[8-10-11]；以此基礎(chǔ)構(gòu)建轉(zhuǎn)染效率高、含氣聲學(xué)增強(qiáng)效果好的質(zhì)粒[2-12-13]，使質(zhì)粒DNA包裹、附著于微泡，應(yīng)用范圍廣，能有效輸送基因的非病毒分子靶向多功能載體系統(tǒng)[10-14-15]任重道遠(yuǎn)。UTMD納米微粒多功能載體系統(tǒng)前景較好，有待更深入的研究。

[1] Nolsφe CP.US-Guided Ablation Techniques Review and Future Aspects.The 12 th Congress of the World Federation for Ultrasound in Medicine and Biology. 30 August - 3 September 2009 Sydney,Australia.

[2] 陳智毅.超聲微泡靶向破壞技術(shù)應(yīng)用與基因傳輸?shù)难芯窟M(jìn)展[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（1）:88-90.

[3] Turk CT, Oz UC, Serim TM, et al.Formulation and Optimization of Nonionic Surfactants Emulsified Nimesulide-Loaded PLGA-Based Nanoparticles by Design of Experiments[J].AAPS PharmSciTech,2014,15(1):161-76.

[4] Feng Q,Wu J,Fan Q,et al.Preparation of uniform-sized exenatide-loaded PLGA microspheres as long-effective release system with high encapsulation efficiency and bio-stability[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2013,112(12):492-498.

[5] 張海，李瑩，唐建熹，等.超聲輻照促生物可降解納米多聚體體內(nèi)釋放DNA的研究[J].中華超聲影像醫(yī)學(xué)雜志,2011，20（6）：533-536

[6] Kost J, Leong K, Langer R,et al.Ultrasound enhanced polymer degradation and release of incorporated substances[J].Proc. Nati Acad,1989，86（10）：7663-7666.

[7] 王剛，潘麗，張永光.PLGA納米/微球作為核酸載體的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2009,36(12):1901-1908

[8] Aspreet J,Vasira K,Labhasetwar V.Biodegradable nanoparticles for cytosolic delivery of therapeutics[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2007,59（8）：718-728.

[9] 張海,李瑩,陳善義,等.超聲與造影劑促,VEGF siRNA抑制鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華超聲影像醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(6):85－88.

[10] 張海，李瑩，李富榮，等.超聲輻照納米聚合物體外控釋DNA效果的研究[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2012，28（9）：773-777.

[11] Zhang H.Ultrasound exposure enhances gene delivery with PLGA-based nanoparticles.12 th Congress of the World Federation for Ultrasound in Medicineand Biology 30 August-3 September 2009 oral speech attend the congress held the sponsorship of the 12 th WFUMB in Sydney, Australia.

[12] Na Z,Chuda C,Cory B.PLGA anoparticle-peptide conjugate effectively targets intercellular cell-adhesion molecule-1[J].Bio conjugate Chem,2008，19(1)：145-152.

[13] El-Sherif DM,Lathia JD,Le NT,et al.Ultrasound degradation of novel polymer contrast agents[J].J Biomed Mater Res A，2004,68(1):71-78.

[14] Jiang GB,Lin ZT,Xu XJ,et al.Stable nanomicelles based on chitosan derivative:In vitro antiplatelet aggregation and adhesion properties Carbohydrate polymer[J]Accepted Manuscript,2012,88(1):232-238.

[15] 張園，朱惠明，李銀鵬，等.超聲靶向微泡破碎介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的研究[J].廣東醫(yī)學(xué)，2011,32(22)：2920-2923.

The Experimental Research in the Effects of Ultrasonication on Degradation of PLGA Released DNA

FAN Hai-bo1, ZHANG Hai1△,LI Ying2△, ZHANG Yuan3, TANG Jian-xi4, CHEN Jun-hui5, LI Ben-yi6
（1.Department of Ultrasound, Second Medical College of Jinan University, Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020,China;2.Radiology Department,Hong Kong university Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000, China;3.Medical Department, Second Medical College of Jinan University,Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020,China;4.Zhuhai city health administration technology,Zhuhai 519000,China; 5.Surgery，Hubei Zhongshan Hospital, Wuhan 430000，China; 6.Kansas University Medical Center, Kansas 66160,USA）

Objective To identify the effective results of ultrasound in degradation of polymeric nanoparticles released DNA .Polymeric nanoparticles was made by dehydration of polyacetylglutamicacid (PLGA, polylactic-co-glycolic acid)solution。MethodGreen Fluorescent Protein (GFP) was enclosed by PLGA. Different kinds of ultrasound mode and different duct cycle and power ones were used to radiate PLGA solution for 90 s, 9 min, 20 min separately after the solution prepared for 2 hrs,then putted the solution on centrifugal machine at 13000 r/m. Using Choloroform to get rid of fat-soluble impurity， then applied nanodrop to survey the releasing rate of DNA. Finally the effect of cell expression were observed by fl uorescent microscope。ResultsThe amount of DNA released from PLGA in groups which were exposed to ultrasound were signi fi cantly different from the groups which were not exposed to ultrosound. The releasing amount of former groups had upper limitation. The releasing rate was increased with the increment of the irradiation time,frequency of ultrasound；The effect of the DNA releasing and PLGA degradation by continuous-wave irradiation was stronger than pulsed-wave ultrasound。ConclusionUltrasound can promote the degradation of PLGA, and do help in DNA releasing and expression in vitro.

ultrasonication; nano-particle; polylactic-co-glycolic acid; deoxyribonucleic acid

Q 681

A

1005-1678(2014)01-0035-03

現(xiàn)代介入影像與治療已發(fā)展到基因納米水平[1]，PLGA具有包裹DNA，攜基因被胞飲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，繼而進(jìn)行功能表達(dá)的作用，且能夠于體內(nèi)生物降解而得到廣泛關(guān)注[2-4]。超聲波具有體內(nèi)促綠色熒光蛋白表達(dá)的作用，我們前期的分子影像學(xué)研究與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)[1-2，5]帶標(biāo)識(shí)的PLGA納米多聚體顆粒孵育2 h可到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，并維持其高濃度。此實(shí)驗(yàn)?zāi)M被胞飲的納米球時(shí)相，進(jìn)行體外超聲促雄激素受體納米多聚體顆粒（NP-PLGA-GFPAR）降解釋放DNA的試驗(yàn)，以了解不同超聲輻照的時(shí)間、聲強(qiáng)、頻率等各種因素對NP-PLGA-GFP-AR的影響，有無促多聚體降解與瞬時(shí)釋放功能。

1 材料與方法

1.1 儀器 德邁超聲儀(1)頻率：(1±0.18)MHz。(2)輸出聲強(qiáng)：≤1.0 w/cm2，峰值超聲聲強(qiáng)：1.0 w/cm2，探頭有效輻照面積3 cm2±5%，PW平均聲強(qiáng)按占空系數(shù)10%；20%；30%；40%；50%分為PW 1-5檔（聲強(qiáng)：0.05～0.25 w/cm2），CW：按占空系數(shù)10%；20%；30%；40%；50%分為CW 1-5檔（聲強(qiáng)：0.1～0.5 w/cm2）；美國泰克Tektronix示波器（TDS 1002）；微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1～18000轉(zhuǎn)／min；微量紫外/可見分光光度計(jì)（美國Nanodrop ND-1000）；將藥學(xué)院定制的NP-PLGAGFP-AR，配制成不同濃度實(shí)驗(yàn)樣本備用。

深圳市戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（JCYJ20130402101926971）;深圳市科技創(chuàng)新二批基礎(chǔ)項(xiàng)目（JCYJ 20120829170525005）；深圳市科技創(chuàng)新國家和省科研項(xiàng)目配套計(jì)劃（ZYC 201105170257 A）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81270857）

范海波，女，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：fhb 123456 abc@163. com；張海，通信作者，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子影像，E-mail：szzhhans@Gmail.com；李瑩，通信作者，女，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：功能影像，E-mail：282251870@qq.com。