王 林 許曉群 王郡甫△

(1濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250062;2濟寧醫(yī)學(xué)院附屬濟寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟寧 272011)

在我國各種惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率中，胃癌位居前列[1]。Wnt信號是維持胚胎發(fā)育、組織完整性及干細胞功能必不可少的，該信號通路異常活化也是導(dǎo)致人類腫瘤發(fā)生最常見異常因素之一[2-4]。原癌基因Wnt10b 是Wnt 基因家族成員之一，其編碼的分泌蛋白激活經(jīng)典的Wnt信號通路。已報道，Wnt10b 高表達與乳腺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-7]。但是，關(guān)于Wnt10b在胃癌組織中的表達及其意義未見報道。本文通過實時定量PCR及Western-blot技術(shù)檢測胃癌及癌旁組織Wnt10b mRNA及蛋白表達水平差異并結(jié)合臨床資料分析Wnt10b在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義，為研究胃癌的發(fā)生發(fā)展及其診斷提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 25例標本選自2012年10月至2013年5月濟寧醫(yī)學(xué)院附屬濟寧市第一人民醫(yī)院腫瘤外科和胃腸外科胃癌手術(shù)患者。入組標準為術(shù)前診斷為胃癌且術(shù)后病理證實，術(shù)前未經(jīng)任何化療和放療。25例中男17例，女8例；年齡29～75歲。其中，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例,無轉(zhuǎn)移5例；中、高分化7例，低、未分化18例；TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期18例,Ⅲ～Ⅳ期7例；浸潤深度:T1 4例，T2 15例，T3 4例，T4 2例。標本取材分為癌組織25例，癌旁正常組織25 例(距離腫瘤組織邊緣5cm 以上，經(jīng)切片病理染色分析證實無癌變細胞)。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本ToYoBo公司)； SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；小鼠抗β-actin抗體(美國abcam公司)；HRP標記的山羊抗小鼠IgG(武漢博士德公司);兔抗Wnt10b抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP 標志的羊抗兔IgG(Rockland公司)；內(nèi)參基因β-actin及目的基因Wnt10b引物設(shè)計采用Primer 軟件，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR儀(東盛創(chuàng)新科技有限公司)，定量PCR儀(BIO-RAD CFX96)。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取 剪取胃癌組織一小塊，剪碎置加入1ml Trizol試劑的研缽中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中反復(fù)吹打，采用異硫氰酸胍—酚—氯仿法提取總RNA。核酸蛋白質(zhì)檢測儀測定RNA樣品濃度。取紫外分光光度計測得A260/A280在1.8～2.0之間，且經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量好的標本進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2qRT-PCR 按ToYoBo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,-20℃?zhèn)溆谩nt10b：上游為5'-GGCTCCAGAATTGCGGTTGT-3'，下游為5'-GGCGCCAGGTGGTAACTGAA-3'。β-actin：上游為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。目的基因的表達水平通過β-actin 進行校準。以cDNA 為模板，采用TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR 反應(yīng),總反應(yīng)體積為20μl，均按試劑說明書操作。

1.2.3Western-blot 剪碎20～40mg新鮮組織，加入1ml預(yù)冷的蛋白裂解液，置冰浴用勻漿器充分勻漿后冰浴10 min。將勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中,4℃ 12000rpm離心15min，取上清置-20℃保存。蛋白質(zhì)樣品分離用80g/L SDS-PAGE，每泳道上樣量為20μg，100V電壓，電泳90～120min 后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將膜與兔抗Wnt10b抗體(1∶500)，室溫孵育2h,漂洗后與HRP 標志的羊抗兔IgG(1∶10000)，室溫溫育1h;然后與內(nèi)參小鼠抗β-actin抗體(1∶1000)室溫孵育2h，漂洗后與HRP 標志的山羊抗小鼠IgG(1∶5000)，室溫孵育1h；ECL熒光顯色，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 Wnt10b mRNA

在胃癌和癌旁組織中的表達 應(yīng)用人Wnt10b特異引物，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板通過實時熒光定量PCR擴增目的基因,并計算其相對表達量。以目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與內(nèi)參基因β-actin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相對變化作為判斷指標，分析胃癌組織與癌旁組織目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示(圖1)，胃癌組織Wnt10b mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于癌旁組織(t=4.366,P=0.0002)。

1：癌旁組織Wnt10b mRNA表達水平 2：胃癌組織Wnt10b mRNA表達水平

圖1 實時熒光定量PCR檢測胃癌及癌旁組織Wnt10b mRNA表達水平

2.2 Wnt10b蛋白質(zhì)在胃癌和癌旁組織中的表達

Western-blot結(jié)果顯示胃癌組織Wnt10b的表達高于癌旁組織，與Wnt10b mRNA轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果完全一致，如圖2。

1、3、5：胃癌組織Wnt10b mRNA蛋白表達水平 2、4、6：癌旁組織Wnt10b mRNA蛋白表達水平

圖2 免疫印跡法檢測胃癌及癌旁組織Wnt10b蛋白表達水平

2.3 胃癌組織Wnt10b mRNA表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Wnt10b mRNA在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),但與年齡、性別、腫瘤大小、分化狀態(tài)、浸潤深度和腫瘤分期無關(guān)，見表1。

表1 胃癌組織Wnt10b mRNA表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

Wnt蛋白是一類脂質(zhì)修飾的分泌型糖蛋白家族，通過細胞表面受體介導(dǎo)的信號途徑調(diào)控一系列的細胞行為，包括細胞分化、增殖、遷移、細胞極性以及基因的表達等[8]。Wnt蛋白與跨膜受體Frizzle以及共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/LRP6)結(jié)合，激活經(jīng)典Wnt途徑，使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累,進而入核與T細胞受體/淋巴增強因子(Tcf/Lef)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活下游靶基因的表達[9]。

迄今為止已發(fā)現(xiàn)Wnt家族至少有19種成員，Wnt10b又名Wnt12，被激活后導(dǎo)致小鼠乳腺腫瘤的發(fā)生[10]，Wend P等[11]研究發(fā)現(xiàn)Wnt10b可以通過活化Wnt/β-catenin通路引起HMGA2的表達促進高侵襲性乳腺癌細胞的增殖，這就表明Wnt10b在促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面具有重要作用。我們從mRNA和蛋白2個層面檢測Wnt10b在胃癌組織和癌旁組織的表達情況，結(jié)果表明Wnt10b在同一病人胃癌組織和癌旁組織的表達具有明顯的差異，這一研究結(jié)果與卵巢癌是一致的[12]。從臨床資料的分析可以看到，Wnt10b在腫瘤組織的表達上調(diào)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，這可能與Wnt10b通過活化Wnt/β-catenin促進腫瘤細胞EMT的改變，降低腫瘤細胞間黏附，加強腫瘤細胞轉(zhuǎn)移所引起的。腫瘤組織中Wnt10b可以來源于腫瘤細胞，也可以來源于腫瘤微環(huán)境細胞[13]，胃癌組織中Wnt10b的高表達是由于腫瘤細胞自身還是由于腫瘤微環(huán)境細胞分泌所致，及其作用機制還有待于進一步的探討?？傊疚慕Y(jié)果表明胃癌組織Wnt10b的表達高于癌旁組織，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，為我們的理解胃癌的發(fā)生發(fā)展具有指導(dǎo)意義，為胃癌的分子診斷和靶向治療提供實驗依據(jù)。

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