崔雅璠+++楊曉青+++段鳳陽++++翟宗崗++劉麗雅

[摘要] 目的 觀察過敏性紫癜性腎炎（HSPN）患兒及健康兒童血清IgA1對小鼠腎小球系膜細胞（MES）增殖及TNF-α分泌的影響。 方法 采集2013年5～12月于河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科住院的40例HSPN患兒及20名健康兒童血清；通過Jacalin親和層析聯(lián)合Superdex-200分子篩層析的方法將血清中單聚體IgA1（mIgA1）純化、分離，將mIgA1熱聚合為聚合IgA1（aIgA1）；采用不同濃度的患兒及健康兒童的aIgA1分別刺激MES細胞株，用MTT法檢測24 h及48 h的細胞增殖情況；收集培養(yǎng)48 h的細胞培養(yǎng)基上清，用ELISA法測定TNF-α的水平。 結(jié)果 在HSPN患兒aIgA1刺激結(jié)果中，不同濃度aIgA1刺激組間MTT實驗吸光度的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），24 h MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照比較，aIgA1刺激濃度在250、1000 μg/mL時，細胞增殖差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在aIgA1濃度為500和750 μg/mL時，細胞增殖差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；48 h MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照比較，在aIgA1刺激濃度50 μg/mL時，細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在100～1000 μg/mL時，細胞增殖差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。健康兒童在aIgA1刺激濃度在750和1000 μg/mL可刺激MES增殖，與陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。HSPN患兒aIgA1可刺激MES分泌TNF-α水平升高，與陰性對照比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），且隨aIgA1濃度增加呈上升趨勢。 結(jié)論 HSPN患兒aIgA1可刺激MES增殖及分泌TNF-α水平增加，且這一結(jié)果具有濃度依賴性及飽和性。

[關(guān)鍵詞] 紫癜性腎炎；IgA1；系膜細胞；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R725.5[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（c）-0017-06

Effects of aIgA1 from children patients with henoch-schonlein purpura nephritis on glomerular mesangial cell proliferation and TNF-α secretion

CUI Yafan1 DING Ying2 YANG Xiaoqing2 DUAN Fengyang2 ZHAI Zonggang3 LIU Liya3

1.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2.Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of He'nan University of TCM, He'nan Province, Zhengzhou 450003, China; 3.He'nan University of TCM, He'nan Province, Zhengzhou 450000, China

[Abstract] Objective To explore the effects of IgA1 isolated from both children patients with HSPN and healthy controls on proliferation and the level of TNF-α of MES. Methods Serum of 40 children with HSPN and 20 healthy children in the First Affiliated Hospital of He'nan University of TCM were collected from May to December 2013. IgA1 was purified from by Jacalin affinity chromatography and molecular sieve chromatography, then aggregated into aIgA1. MES was stimulated by different concentrations of aIgA1 with both children patients of HSPN and healthy controls, and the effects of different concentration aIgA1 on cells proliferation and the changes of secretion level for TNF-α were observed and contrasted. Results By the IgA1 stimulating of children patients with HSPN, there werestatistical differences among the MTT absorbency of mesangial cell in different concentration stimulation of aIgA1 (P < 0.05). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant differences at the concentration of aIgA1 from 250 μg/mL to 1000 μg/mL of HSPN childern (P < 0.05), and the absorbency had high statistical significances at the concentration of aIgA1 from 500 μg/mL to 750 μg/mL of HSPN children at 24 h (P < 0.01). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant difference at the concentration of aIgA1 in 50 μg/mL of HSPN children (P < 0.05), and the absorbency had high statistical significances at the concentration of aIgA1 from 100 to 1000 μg/mL of HSPN children at 48 h (P < 0.01). Compared with negative control, the absorbency had statistically significant differences at the concentration of aIgA1 from 750 μg/mL to 1000 μg/mL of healthy children (P < 0.05). Compared with negative control, aIgA1 of children patients with HSPN could stimulate the secretion of TNF-α, and the level of TNF-α of HSPN chiuldren had high statistical significances (P < 0.01). Conclusion The aIgA1 of children patients with HSPN can stimulate the cells proliferation and increase the secretion of TNF-α, and this result has the concentration-dependent and saturation.

[Key words] Henoch-schonlein purpura nephritis (HSPN); IgA1; Mesangial cell; Tumor necrosis factor-α

過敏性紫癜性腎炎（henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN）是過敏性紫癜主要表現(xiàn)之一，是決定過敏性紫癜預(yù)后的最重要因素。在我國HSPN居小兒繼發(fā)性腎病的首位，且近年來其發(fā)病率有上升趨勢，嚴重危害著兒童健康[1]。IgA在HSPN的發(fā)病中起著重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)在過敏性紫癜患者急性期血清中IgA及IgA1水平均明顯升高[2]，且有腎臟損害的患者血清IgA1水平較無腎臟損害的患者更高[3]，認為HSPN患者血中IgA尤其是IgA1水平升高。IgA在系膜區(qū)的沉積引起系膜細胞的增生是HSPN的主要病理改變，也是造成腎小球損傷的重要環(huán)節(jié)之一，且研究發(fā)現(xiàn)在其中主要起致病作用的是聚合型IgA1（polymeric IgA1，pIgA1）[4]。為了探討HSPN患者的IgA1對系膜細胞損傷的影響，本研究擬通過MTT法觀察HSPN患兒及健康兒童IgA1對系膜細胞增殖的影響，并通過ELISA法檢測兩種IgA1對系膜細胞分泌TNF-α的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選2013年5～12月于河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科住院的40例HSPN患兒及同一時期的20名健康兒童作為研究對象。HSPN患兒符合臨床HSPN診斷標準，男23例，女17例，年齡4～18歲，平均（9.15±2.94）歲。所有患兒尿沉渣檢查紅細胞5/HP～+++之間，尿蛋白+～+++，肝腎功能正常。除外系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型病毒性肝炎等其他疾患。20名健康兒童，男8名、女12名，年齡3～14歲，平均（8.12±2.35）歲。近1個月無呼吸道、胃腸道等黏膜感染史，肝腎功能正常，無鏡下血尿和蛋白尿。抽取患兒及健康兒童靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min后以3000 r/m離心15 min，收集血清于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Agarose-Jacalin親和填料購自Invitrogen公司，蜜二糖購自aladdin公司，小鼠抗人IgAl-UNLB（clone b 3506B4）抗體購自Southern Biotechnology公司，HRP標記-山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體購自中杉金橋公司，50 kD/2 mL超濾離心管購自pall公司，胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司，DMEM/F-12 1∶1購自HyClone公司，噻唑藍（MTT）購自Solarbio公司，小鼠腫瘤壞死因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IgA1的分離、純化及鑒定采用Jacalin-agarose親和層析聯(lián)合分子篩層析法分離、純化得到IgA1血清樣品[5]。具體如下：用10 mmol/L PBS pH 7.4緩沖液等體積稀釋，加至Jacalin親和柱，流速0.5 mL/min，循環(huán)上樣6次；用175 mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液洗脫，直至洗脫液在280 nm的OD值小于1 mAU；收集親和柱解離樣品用超微量分光光度計測定其濃度；將解離樣品用50 kD超濾膜，4℃，4000 r/min，濃縮到0.5 mL。經(jīng)濃縮的Jacalin親和柱解離樣品于Superdex-200分子篩上樣，用10 mmol/L PBS pH 7.4緩沖液進行洗脫，速度0.4 mL/min；通過280 nm的OD吸收值，收集洗脫峰，共4個峰；經(jīng)SDS-PAGE電泳及鼠抗人IgA1及HRP標記的羊抗鼠抗體做Western Blot鑒定，證實2峰多聚體IgA1（pIgA1），3峰為單聚體IgA1（mIgA1）；收集2峰、3峰洗脫液，用超微量分光光度計測定其濃度。取mIgA1 63℃保溫150 min，4℃下12000 r/min離心5 min，將mIgA1熱聚合為aIgA1。

1.3.2 系膜細胞的培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞（SV40 MES 13）購自上海中科院細胞庫。用含5%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，95%空氣和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱，每2~3天換液1次，待細胞長至80%～90%融合時傳代或凍存[6]。

1.3.3 aIgA1刺激系膜細胞后細胞增殖的測定采用MTT比色法，具體如下：將生長良好的SV40 MES 13細胞用含5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基濃度稀釋為2.5×104/mL，按每孔5000個、體積200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，置于條件為37℃、95%空氣和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞貼壁后以含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞18～24 h，使細胞同步化于G0期。用終濃度為50、100、250、500、750、1000 μg/mL的HSPN患兒及健康兒童aIgA1溶于含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基中，分別刺激細胞24 h和48 h，設(shè)1組用含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1、不含刺激物的培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對照組，另設(shè)1組用含5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)為陽性對照組。在刺激結(jié)束前4 h，于每孔中加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄去上清液，每孔中加入150 μL DMSO吹打后，搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。酶標儀上檢測每孔OD值，波長設(shè)為492 nm，以無細胞只加0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基的溶液為基準調(diào)零。

1.3.4 aIgA1刺激系膜細胞后TNF-α分泌水平的測定采用以含0.5%FBS的DMEM/F-12 1∶1培養(yǎng)基稀釋的終濃度為0、50、100、250、500 μg/mL HSPN患兒及健康兒童aIgA1刺激系膜細胞48 h，收集各組上清液保存于-70℃?zhèn)溆?。實驗前從冰箱中取出樣品及酶?lián)檢測試劑盒及待測上清液平衡至室溫。參照小鼠腫瘤壞死因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒說明書建立標準曲線并進行樣本檢測，每個樣本設(shè)5個復孔，酶標儀測量波長為450 nm，根據(jù)待查樣本OD值在標準曲線中查出TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0醫(yī)用統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復測量的計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HSPN患兒及健康兒童血清IgA1濃度的比較

HSPN患兒pIgA1濃度為65～170 μg/mL，平均（124±34）μg/mL；mIgA1濃度為101～498 μg/mL，平均（346±92）μg/mL。健康兒童pIgA1濃度為58～95 μg/mL，平均（73±13）μg/mL；mIgA1濃度為131～234 μg/mL，平均（173±31）μg/mL。HSPN患兒mIgA1及pIgA1濃度均顯著高于健康兒童，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。

2.2 aIgA1刺激系膜細胞對細胞增殖的影響

2.2.1 HSPN患兒aIgA1刺激系膜細胞24 h及48 h的MTT實驗結(jié)果HSPN aIgA1刺激系膜細胞24 h后的MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照比較，aIgA1刺激濃度達250 μg/mL時，細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），且aIgA1刺激濃度在250、1000 μg/mL時，細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在aIgA1濃度為500、750 μg/mL時，細胞增殖差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1。

表1 HSPN aIgA1刺激系膜細胞24 h MTT實驗 OD值結(jié)果（n=5）

注：P值表示與陰性對照比較

48 h后的MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照比較，aIgA1刺激濃度達50 μg/mL時，細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），在100～1000 μg/mL的刺激濃度時與陰性對照相比較，細胞增殖差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表2。

表2 HSPN aIgA1刺激系膜細胞48 h MTT實驗實驗OD值結(jié)果（n=5）

注：P值表示與陰性對照比較

24 h及48 h aIgA1刺激系膜細胞增殖趨勢圖顯示：aIgA1刺激濃度在0～500 μg/mL之間時隨著濃度的增大，系膜細胞的增殖呈遞增趨勢；在500～750 μg/mL之間增殖達最高峰；而當aIgA1濃度增至1000 μg/mL，系膜細胞的增殖較前有所下降。見圖1。

與陰性對照比較，*P < 0.05，&P < 0.01

圖1 HSPN aIgA1刺激系膜細胞增殖24 h及48 h趨勢圖

2.2.2 健康兒童aIgA1刺激系膜細胞24 h及48 h的MTT實驗結(jié)果健康兒童aIgA1刺激系膜細胞24 h后的MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，aIgA1刺激濃度在0～500 μg/mL時，增殖結(jié)果與陰性對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；aIgA1刺激濃度在750～1000 μg/mL時，增殖結(jié)果與陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），系膜細胞呈增殖趨勢。見表3。

表3 健康兒童aIgA1刺激系膜細胞24 h MTT實驗 OD值結(jié)果（n=5）

注：P值表示與陰性對照比較

48 h后的MTT實驗結(jié)果顯示：與陰性對照比較，aIgA1刺激濃度在0～500 μg/mL時，各濃度的增殖結(jié)果與陰性對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），aIgA1刺激濃度在750～1000 μg/mL之間時，增殖結(jié)果與陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），系膜細胞呈增殖趨勢。見表4。

表4 健康兒童aIgA1刺激系膜細胞48 h MTT實驗OD值結(jié)果（n=5）

注：P值表示與陰性對照比較

24 h及48 h不同濃度組間比較的趨勢圖發(fā)現(xiàn)，在0～500 μg/mL之間無明顯差異，在0～500 μg/mL之間隨aIgA1濃度升高呈遞增趨勢。見圖2。

2.3 aIgA1刺激系膜細胞后TNF-α分泌水平的影響

在用不同濃度HSPN和健康兒童血清aIgA1刺激系膜細胞48 h后收集細胞上清培養(yǎng)液用ELISA檢測的TNF-α含量的結(jié)果顯示：HSPN的aIgA1在50、100、250、500 μg/mL 4個刺激濃度下，均能刺激系膜細胞分泌的TNF-α含量增高，較陰性對照比較有差異高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），且含量呈遞增趨勢。健康兒童的aIgA1在50、100、250、500 μg/mL 4個刺激濃度下，刺激系膜細胞分泌的TNF-α含量與陰性對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖3。

與陰性對照比較，&P < 0.01

圖3 HSPN及健康兒童aIgA1刺激系膜細胞分泌TNF-α水平變化

3 討論

本研究采用Jaclin親和層析聯(lián)合Superdex-200分子篩層析成功的將血清中的mIgA1及pIgA1分離出來，并發(fā)現(xiàn)血清中以mIgA1為主要存在形式，與以往文獻報道相符[7]，通過熱聚合的方式可以將IgA1單體聚合為聚合體形式。

腎小球系膜細胞具有很多功能，它在結(jié)構(gòu)上支撐毛細血管[8]，還具有內(nèi)分泌功能，分泌腎素和多種酶類物質(zhì)對腎小球內(nèi)血流量進行局部調(diào)節(jié)[9]，可以分泌細胞基質(zhì)，具有單核-巨噬細胞的作用吞噬和清除沉積于系膜區(qū)的大分子物質(zhì)，可以分泌、產(chǎn)生多種細胞因子介導各種免疫反應(yīng)，還有似平滑肌細胞的收縮功能從而調(diào)節(jié)腎小球的濾過率[10]。HSPN的主要病理改變之一是系膜細胞的增生，系膜細胞增生后可分泌大量的細胞因子，激活多種免疫反應(yīng)機制，可促進炎性反應(yīng)的發(fā)生，導致大量炎癥細胞的浸潤，并可使分泌的大量細胞外基質(zhì)在系膜區(qū)聚集、沉積，如Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等，從而引起腎小球的纖維化[11-13]。目前在IgA1對系膜細胞損傷的研究中，多以IgA腎病為模型，針對HSPN的研究少見，研究發(fā)現(xiàn)在IgA腎病中，IgA1存在結(jié)構(gòu)異常，即IgA1的鉸鏈區(qū)與O-糖基鏈的上的GalNAc連接位點減少有關(guān)，呈低糖基化。異常糖基化IgA1不易與肝細胞接觸，從而順利通過腎小球系膜細胞沉積于系膜區(qū)，且與系膜細胞上的IgA1特異性受體結(jié)合能力增強，更容易黏附于系膜細胞上[14-15]，觸發(fā)了系膜細胞的活化、增殖，多種炎性細胞因子（如TNF-α、IL-6等）的釋放，促使系膜基質(zhì)的增生，纖連蛋白和膠原等在腎小球沉積，最終形成腎小球纖維化[16-17]。Lai等[18]發(fā)現(xiàn)在IgA腎病中，由系膜細胞分泌、合成的TNF-ɑ是導致腎小球-小管損傷的很重要的一個介質(zhì)。并通過研究發(fā)現(xiàn)在IgA腎病中系膜細胞的分泌的TNF-ɑ可以中和抗TNF-ɑ抗體，促進足細胞分泌TNF-ɑ，并可以上調(diào)TNF-α受體1及TNF-α受體2的表達，造成腎臟損傷加重。因HSPN與IgA腎病具有相似的系膜細胞上的病理改變，且在HSPN患者中的IgA1也同樣存在異常糖基化[19]，據(jù)此本研究推測HSPN患者的IgA1是否可以通過觸發(fā)系膜細胞的活化增殖及細胞因子的釋放，從而造成腎小球的損傷。

在用不同濃度的HSPN患兒及健康兒童的aIgA1刺激系膜細胞的MTT實驗結(jié)果提示：HSPN及健康兒童的aIgA1均能刺激系膜細胞增生，但作用濃度不同。在24 h結(jié)果中，HSPN組的aIgA1在250 μg/mL濃度下可出現(xiàn)系膜細胞的增殖，且隨濃度的增高增殖越明顯，而健康兒童的aIgA1在750 μg/mL才出現(xiàn)細胞的增殖。在48 h結(jié)果中，HSPN組的作用更明顯，aIgA1在50 μg/mL濃度下可出現(xiàn)系膜細胞的增殖，且隨濃度的增高增殖越明顯，而這種增殖趨勢在500、750 μg/mL時達到最明顯，而在1000 μg/mL時反而出現(xiàn)了增殖趨勢下降的表現(xiàn)；而健康兒童的aIgA1在750 μg/mL才出現(xiàn)細胞的增殖的表現(xiàn)。HSPN患兒aIgA1刺激系膜細胞的MTT增殖實驗結(jié)果說明aIgA1刺激系膜細胞導致的細胞增殖具有濃度依賴性及飽和性，即在一定濃度范圍內(nèi)，aIgA1的濃度越高，對系膜細胞的增殖作用越明顯，而當達到一定濃度時，這種增殖作用達到飽和不會再增強反而會逐漸減弱。健康兒童aIgA1在低濃度下不能刺激系膜細胞增殖，只有在高濃度范圍內(nèi)才會引起系膜細胞增殖明顯。比較兩種來源aIgA1所產(chǎn)生刺激結(jié)果不同的原因主要考慮有兩方面：一是高濃度的aIgA1對系膜細胞本身有毒性作用，即在高濃度狀態(tài)下，刺激系膜細胞的增殖是非特異性的，而是因為刺激物對細胞毒性反應(yīng)產(chǎn)生的細胞損傷表現(xiàn)；另外一種可能就是在健康兒童IgA中也存在致病的IgA1類型，但是含量較少，而當致病IgA1濃度達到一定水平后，也可刺激系膜細胞導致其增殖。另外aIgA1刺激系膜細胞導致的細胞增殖還具有時效性，48 h的細胞增殖較24 h的增殖更顯著。本研究通過ELISA的方法檢測HSPN及健康兒童兩組不同濃度的aIgA1刺激系膜細胞48 h分泌的TNF-α的含量變化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0～500 μg/mL范圍內(nèi)HSPN的aIgA1刺激系膜細胞后可導致TNF-α的分泌增多，且TNF-α的含量隨刺激的aIgA1濃度的升高而增加更明顯，即這個結(jié)果與aIgA1的濃度呈正相關(guān)；而健康兒童的aIgA1不能刺激系膜細胞分泌更多的TNF-α。

根據(jù)以上結(jié)果推測，HSPN患兒的IgA1因其分子結(jié)構(gòu)或功能的異常更易于在腎臟沉積，易于與系膜細胞結(jié)合，從而導致系膜細胞的活化、增殖，并且誘導系膜細胞分泌更多的TNF-α，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)進一步參與的腎小球的損傷過程。

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[19]劉云，徐漢云.過敏性紫癜腎炎患兒IgA1異常糖基化的研究[J].實用臨床醫(yī)學2013，14（1）：81-82.

（收稿日期：2014-03-18本文編輯：蘇暢）

根據(jù)以上結(jié)果推測，HSPN患兒的IgA1因其分子結(jié)構(gòu)或功能的異常更易于在腎臟沉積，易于與系膜細胞結(jié)合，從而導致系膜細胞的活化、增殖，并且誘導系膜細胞分泌更多的TNF-α，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)進一步參與的腎小球的損傷過程。

[參考文獻]

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[7]郭紅，于仲元，梁志錦.IgA腎病患者血清IgAl的測定和分析[J].醫(yī)師進修雜志，2002，25（8）：19-25.

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根據(jù)以上結(jié)果推測，HSPN患兒的IgA1因其分子結(jié)構(gòu)或功能的異常更易于在腎臟沉積，易于與系膜細胞結(jié)合，從而導致系膜細胞的活化、增殖，并且誘導系膜細胞分泌更多的TNF-α，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)進一步參與的腎小球的損傷過程。

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（收稿日期：2014-03-18本文編輯：蘇暢）