張?jiān)迄i, 溫 彤, 姜 偉

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193

在發(fā)酵工業(yè)中，菌種無(wú)疑是影響產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量最重要的因素之一。早期研究中通常通過(guò)定向篩選自然突變的方法得到發(fā)酵菌種，此種方法耗時(shí)長(zhǎng)、效率低。隨后出現(xiàn)的物理/化學(xué)誘變技術(shù)提高了菌種篩選的速度，提高了篩選及生產(chǎn)效率。從20世紀(jì)70年代起，隨著分子生物學(xué)及基因組學(xué)的快速發(fā)展，各種工程菌株遺傳操作體系的完善，已能十分方便地利用微生物進(jìn)行多種蛋白質(zhì)疫苗、核酸疫苗和酶制劑等的發(fā)酵生產(chǎn)。利用原核及真核表達(dá)系統(tǒng)和高度發(fā)展的自控發(fā)酵設(shè)備生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)物是近十年來(lái)發(fā)酵工業(yè)最為活躍的領(lǐng)域之一。本文從表達(dá)載體和宿主菌改造兩方面綜述了大腸桿菌和酵母工程菌株構(gòu)建與改造的新進(jìn)展與新技術(shù)。

1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

1.1大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

以大腸桿菌為代表的原核生物由于易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)勢(shì)成為原核工程菌的代表菌株。大腸桿菌中應(yīng)用最普遍的工程菌是大腸桿菌BL21(DE3)。BL21是λDE3大腸桿菌溶源菌，包含受控于lacUV5啟動(dòng)子的T7 RNA聚合酶表達(dá)基因，在有乳糖或IPTG存在的情況下表達(dá)T7 RNA聚合酶，可以快速大量地啟動(dòng)T7啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)。在過(guò)去20年中廣泛應(yīng)用的表達(dá)載體主要有pGEX系列、pQE系列與pET系列。目前pET系列仍然是普遍使用的一種高效表達(dá)載體。pET表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)原理主要是應(yīng)用LacI/Pt7lac啟動(dòng)子，使得目的基因在有誘導(dǎo)物的情況下大量表達(dá)。但是在這種外源蛋白大量表達(dá)的情況下，過(guò)量表達(dá)的目的蛋白很容易導(dǎo)致包涵體的形成。為了改變這種情況，英濰捷基公司(Invitrogen Co.)在pET表達(dá)載體基礎(chǔ)上開發(fā)了pET SUMO表達(dá)系統(tǒng)。這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)在目的蛋白前加入了SUMO元件以提高目的蛋白的溶解性。在目的蛋白的純化過(guò)程中可利用SUMO蛋白酶將SUMO元件切下以得到原始蛋白。pET SUMO載體圖譜如圖1所示[1]。

圖1 pET SUMO質(zhì)粒圖譜[1]

2013年，Balzer等[2]通過(guò)構(gòu)建一系列的表達(dá)載體評(píng)價(jià)了5個(gè)調(diào)節(jié)子/啟動(dòng)子組合XylS/Pm(野生型)、XylS/PmML1-17(Pm突變體)、LacI/PT7lac、LacI/Ptrc和AraC/PBAD的轉(zhuǎn)錄效率和表達(dá)效率。他們發(fā)現(xiàn)：在5個(gè)調(diào)節(jié)子/啟動(dòng)子組合中目的基因的表達(dá)效率與質(zhì)粒的拷貝數(shù)有關(guān)；LacI/PT7lac的轉(zhuǎn)錄活性最高；而LacI/PT7lac和XylS/PmML1-17表達(dá)活性蛋白的能力高于其余3組啟動(dòng)子；在5組啟動(dòng)子中XylS/PmML1-17的應(yīng)用最靈活，因?yàn)槠鋵?duì)宿主菌的要求比較低；AraC/PBAD啟動(dòng)子在不受誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的情況下表達(dá)量最低，說(shuō)明其下游基因的表達(dá)是受到嚴(yán)格調(diào)控的，并且這個(gè)啟動(dòng)子具有最高效的5′UTR。

1.2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化

為了提高蛋白的表達(dá)量，并使蛋白正確的折疊，具有蛋白活性，研究人員進(jìn)行了一系列的嘗試。Lopez等[3]通過(guò)突變RNA酶延長(zhǎng)了mRNA的半衰期，從而延長(zhǎng)蛋白翻譯的時(shí)間，使得MukB蛋白的表達(dá)量提高了2倍；利用某些分子伴侶蛋白可以幫助目的蛋白折疊的特性[4]，將這些分子伴侶與目的蛋白共表達(dá)以促進(jìn)蛋白的折疊；Bessette等[5]通過(guò)突變大腸桿菌中與氧化還原相關(guān)的蛋白使大腸桿菌胞質(zhì)處于氧化狀態(tài)，促進(jìn)了帶有二硫鍵的蛋白的表達(dá)；Wacker等[6]通過(guò)將pGL操縱元導(dǎo)入大腸桿菌解決了大腸桿菌表達(dá)蛋白N端糖基化的問(wèn)題；Johnson等[7]最近發(fā)現(xiàn)將目的蛋白與酵母中NatB蛋白以及其底物蛋白共表達(dá)可以解決大腸桿菌表達(dá)人與酵母中部分乙?；鞍椎膯?wèn)題。

除了對(duì)外源載體以及分子伴侶進(jìn)行研究外，對(duì)于宿主菌的改造也是原核表達(dá)載體改造中的重要一環(huán)。對(duì)于宿主菌的改造主要是通過(guò)對(duì)宿主菌隨機(jī)突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選得到高效表達(dá)的菌株，隨后再通過(guò)對(duì)高效表達(dá)的菌株進(jìn)行基因組水平的分析，找到突變基因，分析其在宿主菌代謝調(diào)控中所起到的作用[8]，通過(guò)從表型反推基因型的正向遺傳學(xué)方法可以使我們對(duì)于某個(gè)基因在代謝過(guò)程中所起到的作用有更深刻的理解。目前，比較好的篩選數(shù)據(jù)庫(kù)主要是Keio數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含了大腸桿菌K-12的所有非致死突變[9]，為大腸桿菌宿主菌改造提供了極大的便利。最近，Bowie等[10]通過(guò)堿基類似物2-氨基嘌呤突變以及突變基因mutD5的應(yīng)用對(duì)大腸桿菌TOP10進(jìn)行了突變，使得其對(duì)一系列真核和原核基因的表達(dá)量提高了90倍；Makino等[11]利用化學(xué)誘變的方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造使得其表達(dá)IgG的能力提高了5倍。

大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的研究已經(jīng)非常成熟，為科學(xué)研究和發(fā)酵生產(chǎn)行為提供了極大的便利，但是仍然有一部分與外源蛋白表達(dá)相關(guān)的調(diào)控通路未知，需要進(jìn)一步的探究。

2 酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

酵母表達(dá)體系是目前工業(yè)生產(chǎn)中非常重要的一種真核表達(dá)體系，可以通過(guò)分泌途徑將目的蛋白分泌出菌體外，提取程序簡(jiǎn)便，為工業(yè)生產(chǎn)提供了極大便利，并且在發(fā)酵生產(chǎn)安全性要求高的蛋白產(chǎn)品(如食品、藥品等)方面具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。近些年來(lái)，藥用蛋白在臨床醫(yī)學(xué)中的作用越來(lái)越大，據(jù)估計(jì)其市場(chǎng)價(jià)值可達(dá)到每年700億～800億美元，并且以每年7％～15％的速度增長(zhǎng)[12,13]。盡管原核表達(dá)體系已經(jīng)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，并且也可進(jìn)行一系列的糖基化或乙?；男揎棧湓谒幬锏鞍妆磉_(dá)領(lǐng)域仍然具有一定的局限性與缺陷。就目前而言，考慮到藥用蛋白的安全性與某些蛋白的特殊性，部分表達(dá)宿主還優(yōu)先選擇真核生物，如酵母工程菌株。藥用蛋白表達(dá)宿主酵母菌主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、畢赤酵母(Pichiapastoris)以及耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)，其中以釀酒酵母的應(yīng)用最為廣泛。1996年釀酒酵母基因組作為第一個(gè)真核基因組發(fā)布[14]，促進(jìn)了酵母遺傳學(xué)的研究，也為將釀酒酵母作為藥用蛋白表達(dá)宿主打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.1酵母表達(dá)載體

在釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中，常用的表達(dá)質(zhì)粒是pYC2-E(見圖2A)[15]。在這個(gè)表達(dá)載體中，目的蛋白的表達(dá)受到半乳糖激酶啟動(dòng)子的控制，當(dāng)有半乳糖存在時(shí)，宿主菌表達(dá)半乳糖激酶以分解半乳糖獲得能量，同時(shí)啟動(dòng)半乳糖激酶啟動(dòng)子下游基因的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到外源蛋白表達(dá)的目的。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，英濰捷基公司提供的表達(dá)載體主要有誘導(dǎo)型表達(dá)載體和組成型表達(dá)載體兩種。組成型表達(dá)載體pGAPZ(見圖2B)[16]以3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子為外源蛋白表達(dá)啟動(dòng)子，不需要誘導(dǎo)。而誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICZα(見圖2C)[17]以醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，只有在甲醇存在的情況下外源基因才能開始轉(zhuǎn)錄。

圖2 釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pYC2-E，畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPZ和誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICZα質(zhì)粒圖譜[15～17]

2.2目的基因表達(dá)框的改造

為了提高外源蛋白在酵母中表達(dá)量，首先應(yīng)對(duì)目的蛋白基因的啟動(dòng)子進(jìn)行改造或替換。在釀酒酵母中常用的高效表達(dá)啟動(dòng)子主要是TEF1和GPD(TDH3)。近些年來(lái)，主要通過(guò)隨機(jī)合成寡核苷酸技術(shù)[18]和錯(cuò)配PCR技術(shù)[19]對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行突變，以期得到表達(dá)活性更高的啟動(dòng)子。在畢赤酵母中，三磷酸甘油醛啟動(dòng)子GAP的轉(zhuǎn)錄活性也通過(guò)隨機(jī)突變的方法得到了提高[20]。

除了以上的組成型表達(dá)啟動(dòng)子外，也有誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。在釀酒酵母中常用的誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子主要是GAL1和GAL10。由于這兩個(gè)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物是半乳糖，半乳糖可以當(dāng)做酵母的碳源而被消耗導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)的控制變得復(fù)雜，加之半乳糖價(jià)格較貴，阻礙了這兩個(gè)啟動(dòng)子在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。最近，McIsaac等[21]將6個(gè)Zif268結(jié)合位點(diǎn)與一個(gè)經(jīng)過(guò)改造的GAL1啟動(dòng)子聯(lián)合使用，使得GAL1在Z3EV轉(zhuǎn)錄因子存在時(shí)的表達(dá)更可控。在畢赤酵母中，最常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是AOX1啟動(dòng)子。由于AOX1啟動(dòng)子是甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在工業(yè)生產(chǎn)中使用甲醇存在安全隱患，所以現(xiàn)已通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造以提高其轉(zhuǎn)錄效率并改變其甲醇誘導(dǎo)的特性[22]。

在酵母表達(dá)體系中除了啟動(dòng)子因素外，密碼子偏好性和質(zhì)?？截悢?shù)也是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素。通過(guò)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其更適應(yīng)宿主的密碼子偏好性，并通過(guò)改變A/T，C/G比例可以有效提高外源蛋白的表達(dá)效率。在質(zhì)粒拷貝數(shù)方面，高拷貝的質(zhì)粒有利于蛋白的大量表達(dá)，但是過(guò)量的蛋白表達(dá)會(huì)加重宿主負(fù)擔(dān)，使得表達(dá)體系不穩(wěn)定。通常情況下，將表達(dá)載體重組在宿主的基因組上有利于外源基因的穩(wěn)定性。但是最近發(fā)現(xiàn)，在酵母中，很多時(shí)候質(zhì)?？截悢?shù)并不與蛋白的表達(dá)量成正比[23]。

2.3宿主菌的改造

在酵母表達(dá)體系的研究過(guò)程中，宿主菌的改造同樣也是研究的一個(gè)重要方向。

由于在酵母中表達(dá)的很多外源蛋白會(huì)分泌到細(xì)胞外，所以對(duì)酵母分泌途徑的改造可以有效提高目的蛋白的產(chǎn)量。蛋白的表達(dá)和分泌主要包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、肽段轉(zhuǎn)移、翻譯后修飾、蛋白折疊、肽段切除、糖基化、包裝和分泌等步驟[24]。翻譯后蛋白首先被轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在這個(gè)過(guò)程中，信號(hào)肽與前導(dǎo)肽起到關(guān)鍵作用。人工合成的缺少N端保守糖基化的α-交配因子的前導(dǎo)肽與釀酒酵母本身的前導(dǎo)肽在引導(dǎo)胰島素分泌的過(guò)程中具有類似的活性[25]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，蛋白的正確折疊是非常重要的，它決定蛋白進(jìn)入分泌途徑還是降解途徑，肽段的錯(cuò)誤折疊會(huì)加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的代謝負(fù)擔(dān)，引起未折疊蛋白反應(yīng)[26,27]。過(guò)量表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊因子和還原酶可以有效改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊，從而提高蛋白質(zhì)的分泌量[27～31]。在分泌途徑的最后一步，蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體以及從高爾基體到細(xì)胞壁的囊泡運(yùn)輸過(guò)程中，兩個(gè)關(guān)鍵蛋白Sly1P和Sec1P的過(guò)量表達(dá)同樣可以有效促進(jìn)蛋白的分泌[32]。

在酵母菌中，存在大量的蛋白酶表達(dá)，這些蛋白酶有些定位于蛋白分泌途徑或作用于蛋白分泌途徑[33]，導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)后的折疊、糖基化等過(guò)程中可能會(huì)被錯(cuò)誤剪切，直接導(dǎo)致蛋白表達(dá)量下降或活性下降。所以對(duì)酵母宿主菌中的蛋白酶系進(jìn)行突變，可以有效減弱這一反應(yīng)，從而提高外源蛋白表達(dá)的產(chǎn)量和質(zhì)量。Cho等[34]通過(guò)對(duì)釀酒酵母中的天冬氨酸蛋白酶YPS1、YPS2、YPS3、YPS6和YPS7進(jìn)行多點(diǎn)突變，使得在釀酒酵母中的甲狀旁腺激素蛋白表達(dá)量有所上升。通過(guò)在其他酵母菌株中突變這些天冬氨酸蛋白酶，發(fā)現(xiàn)這些定位在細(xì)胞表面的天冬氨酸蛋白酶是外源蛋白被錯(cuò)誤剪切的主要原因[35，36]。

近些年來(lái)，對(duì)酵母菌株的改造已不僅僅限于單個(gè)基因的缺失或過(guò)量表達(dá)，而是對(duì)一系列基因的共同改造，以提高外源蛋白的表達(dá)量和活性。

3 展望

近代以來(lái)，隨著細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，代謝控制技術(shù)的建立，尤其是分子生物學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)酵產(chǎn)業(yè)進(jìn)入了高速發(fā)展的階段，創(chuàng)造出了極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在食品、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域做出了巨大的貢獻(xiàn)。

利用分子生物學(xué)手段，科學(xué)工作者構(gòu)建了一系列的真核和原核表達(dá)體系。在大腸桿菌表達(dá)體系中采用技術(shù)主要包括啟動(dòng)子改造、共表達(dá)分子伴侶蛋白和篩選宿主菌株突變體庫(kù)等；而在酵母菌表達(dá)體系中主要應(yīng)用了隨機(jī)突變與人工構(gòu)建啟動(dòng)子、外源蛋白基因密碼子優(yōu)化、宿主菌代謝通路的改造與缺失等技術(shù)。盡管通過(guò)分子生物學(xué)手段構(gòu)建了一系列的高效表達(dá)載體和適合的宿主菌，但是在各宿主菌中仍然存在一些沒(méi)有研究透徹的調(diào)控通路，結(jié)合微生物代謝組等高通量技術(shù)，尋找代謝通路中的關(guān)鍵蛋白，對(duì)這些特定蛋白的過(guò)量表達(dá)與失活進(jìn)行研究，有望進(jìn)一步提高外源蛋白的表達(dá)量及活性。

[1]Invitrogen. ChampionTMpET SUMO protein expression system for high-level expression and enhanced solubility of recombinant proteins inE.coliand cleavage of native protein[EB/OL].http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/pet-sumo_man.pdf, 2010-6-18.

[2]Balzer S, Kucharova V, Megerle J,etal.. A comparative analysis of the properties of regulated promoter systems commonly used for recombinant gene expression inEscherichiacoli[J]. Microb. Cell Fact., 2013, 12：26.

[3]Lopez P J, Marchand I, Joyce S A,etal.. The C-terminal half of RNase E, which organizes theEscherichiacolidegradosome, participates in mRNA degradation but not rRNA processinginvivo[J]. Mol. Microbiol., 1999, 33：188-199.

[4]Houry W A. Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm[J]. Curr. Protein Pept. Sci.,2001,2(3)：227-244.

[5]Bessette P H, Aslund F, Beckwith J,etal.. Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in theEscherichiacolicytoplasm[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96：13703-13708.

[6]Wacker M, Linton D, Hitchen P G,etal.. N-linked glycosylation inCampylobacterjejuniand its functional transfer intoE.coli[J]. Science, 2002, 298：1790-1793.

[7]Johnson M, Coulton A T, Geeves M A,etal.. Targeted amino-terminal acetylation of recombinant proteins inE.coli[J]. PloS ONE, 2010, 5：e15801.

[8]Makino T, Skretas G, Georgiou G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria[J]. Microb. Cell Fact., 2011, 10：32.

[9]Baba T, Ara T, Hasegawa M,etal.. Construction ofEscherichiacoliK-12 in-frame, single-gene knockout mutants：the Keio collection[J]. Mol. Syst. Biol., 2006, 2：2006.0008.

[10]Massey-Gendel E, Zhao A, Boulting G,etal.. Genetic selection system for improving recombinant membrane protein expression inE.coli[J]. Protein Sci., 2009, 18：372-383.

[11]Makino T, Skretas G, Kang T H,etal.. Comprehensive engineering ofEscherichiacolifor enhanced expression of IgG antibodies[J]. Metab. Eng., 2011, 13(2)：241-251.

[12]Goodman M. Market watch：Sales of biologics to show robust growth through to 2013[J]. Nat. Rev. Drug. Discov., 2009, 8(11)：837.

[13]Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2010[J]. Nat. Biotechnol., 2010, 28：917-924.

[14]Goffeau A, Barrell B G, Bussey H,etal.. Life with 6000 genes[J]. Science, 1996, 274(5287)：546,563-567.

[15]Invitrogen. pYES2.1-E and pYC2-EEchoTM-adapted expression vectors：For cloning of the gene of interest using the EchoTMcloning system and expression inSaccharomycescerevisiae[EB/OL]. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/pyes2_1e_pyc2e_man.pdf, 2010-12-29.

[16]Invitrogen. pGAPZ A, B, and C/pGAPZα A, B, and C：Pichiaexpression vectors for constitutive expression and purification of recombinant proteins[EB/OL]. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/pgapz_man.pdf, 2010-06-28.

[17]Invitrogen. pPICZαA, B, and C：Pichiaexpression vectors for selection on ZeocinTMand purification of secreted, recombinant proteins[EB/OL]. http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf, 2010-07-07.

[18]Jeppsson M, Johansson B, Jensen P R,etal.. The level of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity strongly influences xylose fermentation and inhibitor sensitivity in recombinantSaccharomycescerevisiaestrains[J]. Yeast, 2003, 20：1263-1272.

[19]Alper H, Fischer C, Nevoigt E,etal.. Tuning genetic control through promoter engineering[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102(36):12678-12683.

[20]Qin X, Qian J, Yao G,etal.. GAP promoter library for fine-tuning of gene expression inPichiapastoris[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77：3600-3608.

[21]McIsaac R S, Gibney P A, Chandran S S,etal.. Synthetic biology tools for programming gene expression without nutritional perturbations inSaccharomycescerevisiae[J]. Nucleic Acids Res., 2014, 42：e48.

[22]Vogl T, Glieder A. Regulation ofPichiapastorispromoters and its consequences for protein production[J]. N. Biotechnol., 2013, 30(4)：385-404.

[23]Aw R, Polizzi K M. Can too many copies spoil the broth[J]? Microb. Cell Fact., 2013, 12：128.

[24]Hou J, Tyo K E, Liu Z,etal.. Metabolic engineering of recombinant protein secretion bySaccharomycescerevisiae[J]. FEMS Yeast Res., 2012, 12：491-510.

[25]Kjeldsen T, Hach M, Balschmidt P,etal.. Prepro-leaders lacking N-linked glycosylation for secretory expression in the yeastSaccharomycescerevisiae[J]. Protein Expr. Purif., 1998, 14：309-316.

[26]Patil C, Walter P. Intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the nucleus： the unfolded protein response in yeast and mammals[J]. Curr. Opin. Cell Biol., 2001, 13：349-355.

[27]Payne T, Finnis C, Evans L R,etal.. Modulation of chaperone gene expression in mutagenizedSaccharomycescerevisiaestrains developed for recombinant human albumin production results in increased production of multiple heterologous proteins[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74：7759-7766.

[28]Gasser B, Sauer M, Maurer M,etal.. Transcriptomics-based identification of novel factors enhancing heterologous protein secretion in yeasts[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73：6499-6507.

[29]Lodi T, Neglia B, Donnini C. Secretion of human serum albumin byKluyveromyceslactisoverexpressing KlPDI1 and KlERO1[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71：4359-4363.

[30]Smith J D, Tang B C, Robinson A S. Protein disulfide isomerase, but not binding protein, overexpression enhances secretion of a non-disulfide-bonded protein in yeast[J]. Biotechnol. Bioeng., 2004, 85：340-350.

[31]Zhang W, Zhao H L, Xue C,etal.. Enhanced secretion of heterologous proteins inPichiapastorisfollowing overexpression ofSaccharomycescerevisiaechaperone proteins[J]. Biotechnol. Prog., 2006, 22：1090-1095.

[32]Hou J, Tyo K, Liu Z,etal.. Engineering of vesicle trafficking improves heterologous protein secretion inSaccharomycescerevisiae[J]. Metab. Eng., 2012, 14(2)：120-127.

[33]Kim H, Yoo S J, Kang H A. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins[J]. FEMS Yeast Res., 2014, doi: 10.1111/1567-1364.12195.

[34]Cho E Y, Cheon S A, Kim H,etal.. Multiple-yapsin-deficient mutant strains for high-level production of intact recombinant proteins inSaccharomycescerevisiae[J]. J. Biotechnol., 2010, 149(1-2)：1-7.

[35]Sohn S B, Graf A B, Kim T Y,etal.. Genome-scale metabolic model of methylotrophic yeastPichiapastorisand its use for in silico analysis of heterologous protein production[J]. Biotechnol. J., 2010, 5(7)：705-715.

[36]Wu M, Shen Q, Yang Y,etal.. Disruption of YPS1 and PEP4 genes reduces proteolytic degradation of secreted HSA/PTH inPichiapastorisGS115[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2013, 40：589-599.