鄧 龍, 周 思, 郭新東

1.廣東食品藥品職業(yè)學院, 廣州 510520;

2.廣州質量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 510000

隨著基因工程技術的不斷發(fā)展，通過DNA重組技術獲得抗體的基因片段，將重組抗體的基因轉入原核或真核表達系統(tǒng)中在適當條件下表達，已獲得一系列基因工程重組抗體。基因工程重組抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第三代抗體。其在基因水平上的操作非常靈活。可對基因序列進行分析、修飾和加工以改進抗體特性或賦予抗體新的特性，突破以往僅局限于半抗原分子設計的限制。針對基因工程抗體親和力普遍較低；半衰期短，易從血中清除；缺乏Fc片段，只能中和抗原，而不能激活補體系統(tǒng)和介導細胞免疫等缺點，人們希望通過基因工程抗體的靈活性，將抗體進行定向的改造，達到優(yōu)化抗體的目的。

近年來，利用信息技術剖析生命現(xiàn)象的本質成為生命科學工作者所關注的焦點，也由此產生了一門計算機技術與生物學技術相結合的新興學科——生物信息學。要實現(xiàn)基因工程抗體的定向進化需要充分利用計算機模擬、X射線衍射(X-ray)、多維核磁共振(multidimentional NMR spectroscopy)等結構測定技術，通過生物信息學手段分析小分子有機物與抗體相互作用機制，在此基礎上對抗體的基因序列進行修飾、改造，從而達到改進基因工程抗體的目的。

基因工程抗體要進行體外抗體親和力成熟，就必須對體內抗體親和力成熟原理有深入認識，模擬親和力成熟過程中體內存在的變化，促使基因工程抗體的體外進化，才是解決問題的關鍵[1]。

1 小分子有機物—抗體相互作用機制分析

隨著抗體信息學的廣泛開展，現(xiàn)已經有幾種專門針對抗體序列進行分析的數(shù)據庫及分析工具，如Kabat數(shù)據庫、NCBI數(shù)據庫里的Immunoglobin BLAST (IgBlast)、VBASE數(shù)據庫，以及IMGT數(shù)據庫等。研究者可在獲得抗體序列的基礎上，利用這些數(shù)據庫及相應的分析工具進行序列比對以及其他特征的分析。與此同時，在計算機模擬平臺上，研究抗原和抗體的相互作用機制，特別小分子有機物和相應的抗體的相互作用機制已經受到了相當大的關注[2～4]。近年來，借助同源模建(homology modelling)及X射線衍射手段獲取抗體模型，并利用分子動力學、定點突變等技術已經對多種小分子有機物和相應抗體的相互作用機制進行了詳細的研究(見表1)[5～13]，揭示了小分子有機物和相應抗體的相互作用本質。

抗原與抗體間的特異性結合，可用“模板學說”或“鎖與鑰匙學說”來描述[14，15]。通過分子生物學與X射線衍射、多維核磁共振(NMR)等相結合的大分子結構測定技術，許多抗體大分子或者抗體-抗原復合物的三維結構己被測定[16，17]。而對已知一級結構的抗體分子，可采用理論方法、分子模擬方法(如同源蛋白模建方法)預測其三維結構[18]。目前應用較多的在線同源模建工作站有SWISS-MODEL、web of antibody model和Rosetta antibody model server等。獲得抗體模型后，借助各種手段來闡明抗原抗體識別機制，可以指導小分子有機物特異抗體的制備，如交叉反應的避免和抗體親和力的提高等。Hofstetter等[19]分別將氨基酸異構體衍生化后得到的抗原注入動物體內而培養(yǎng)出相應的抗氨基酸的抗體，再將得到的對映異構體的抗體用來識別該氨基酸異構體。而在抗體親和力的提高上，Scotti等[20]通過分析兩個不同親和力的抗苯基唑酮抗體的基因序列，發(fā)現(xiàn)高親和力抗體和低親和力抗體的序列基本相同，只存在9個氨基酸殘基的差異，這些氨基酸殘基差異都位于抗體的重鏈區(qū)。通過X射線衍射對抗原與抗體結合體進行結構分析，發(fā)現(xiàn)表面互補性提高使抗體獲得了較高的親和力，這意味著表面互補性對抗體親和力的成熟具有重要的作用。

表1 抗體與小分子相互作用機制研究

2 基因工程抗體的親和力成熟研究

抗體的親和力一般用親和常數(shù)Ka或者解離常數(shù)Kd來表示，可以反映抗原和抗體的結合程度?？贵w親和力成熟(antibody affinity maturation) 是指機體正常存在的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應答所產生抗體的平均親和力高于初次免疫應答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。這是由于抗體形成細胞本身的基因突變和抗原對B 細胞克隆的選擇性激活。機體的這種功能狀態(tài)是長期進化和對外界環(huán)境不斷適應的結果，對機體防御和維持自身免疫監(jiān)控有著十分重要的意義[21]。

隨著人們對體內抗體親和力成熟的深入研究，體外抗體親和力成熟研究已經成為一個研究熱點。由于抗體的成分絕大部分為蛋白質，因此體外抗體親和力成熟可歸屬于體外功能蛋白質分子進化的范疇。體外抗體親和力成熟一般可以采用隨機突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法和定向引入突變(site-directed mutagenesis)的方法及近來研究比較熱門的基于抗原結合位點結構調整的方法。

2.1隨機突變法

采用隨機突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法一般又有錯配PCR法(error-prone PCR)、DNA改組法(DNA shuffling)和鏈置換法(chain shuffling)等。錯配PCR法通過改變PCR 的條件，使目的基因片段在復制的過程中堿基對發(fā)生錯誤的配對，從而引入突變。Finlay等[22]以隨機突變?yōu)榛A，聯(lián)合運用錯誤傾向PCR、DNA 重組等方法，使親和力提高了110倍。DNA 改組法同樣運用隨機突變的原理，在獲得較大容量的功能蛋白質突變體庫的基礎上，結合運用相應的快速富集篩選方法(主要是以噬菌體表面展示為主的各種表面展示技術) 對突變體進行篩選，最終得到進化的功能蛋白質分子。Kim等[23]結合噬菌體庫展示技術通過DNA 改組把抗體親和力提高了9倍。鏈置換則依據抗體可變區(qū)隨機配對的原理，在抗體的一條鏈保持不變的情況下，將另一條鏈進行替換，之后從中篩選出高親和力的抗體分子。Hur等[24]運用鏈置換技術成功將一個天然抗體的親和力提高了36倍，同時獲得了抗體片段在大腸桿菌中的可溶性表達?？傮w來看，采用隨機突變編碼可變區(qū)的基因片段的方法，隨著研究人員的不斷改進，該技術有了長足的發(fā)展，但是此方法始終有著盲目和隨機性的缺點，使得在相關的研究中對突變的結果較難把握。

2.2定向突變方法

采用定向引入突變的方法的前提是對基因及表達的蛋白產物的三維結構和功能等方面的信息有著較為透徹的了解。研究表明，抗體的互補決定區(qū)集中在一起形成一個特定的三維結構，其中包含了一個和抗原結合的部位，同時互補決定區(qū)突變的頻率也最為頻繁，通過對抗原抗體結合部位的晶體結構的分析，在一定程度上可提示出哪些特定部位的氨基酸殘基可以優(yōu)先突變來提高親和力。近年來，借助計算機軟件同源模建技術，在模擬抗原抗體結合過程中的構象及能態(tài)的變化的基礎上有針對性地對互補決定區(qū)的基因進行突變，已成為一個研究的熱點。Akikazu等[25]通過對一株抗乙酰膽堿Fab重鏈95位上的酪氨酸進行定點突變，替換成為甘氨酸之后，突變體親和力提高了100倍。對于如何選取針對性的突變點，丙氨酸掃描法(alanine scanning)具有一定的優(yōu)勢。丙氨酸掃描突變采用體外定向突變的策略，通過改變密碼子的序列，系統(tǒng)地將丙氨酸置換特殊的氨基酸，然后通過測定抗原抗體解離速率是否下降來確定可進一步優(yōu)化的氨基酸(optimized residue substitution，ORS)，同時對它們進行隨機的突變，可篩選得到解離速率最低的氨基酸，最后僅通過選定氨基酸的置換來提高抗體親和力[26，27]。此方法目的明確，繞開了不好選擇突變頻率的難題，同時避免了隨機突變編碼可變區(qū)基因片段法隨意性大的缺點。

2.3基于抗原結合位點結構調整的方法

通過對抗體親和力成熟的深入研究，已發(fā)現(xiàn)抗原結合位點處的氨基酸對抗體親和力具有顯著的作用。Li等[28]首次運用X射線晶體衍射技術，通過研究抗原-抗體結合的三維構象來研究抗體親和力成熟的過程，研究表明，抗原和抗體的結合面積的加大在抗體親和力成熟過程中并不出現(xiàn)，而可能是抗原結合位點周圍的一些氨基酸殘基的變化增加了疏水性作用力，從而使抗原和抗體的結合更加緊密，互補性增強。Cauerhff等[29]的研究也表明，抗體親和力成熟更重要的可能是一些小結構的變化，尤其是分布在抗原結合部位周圍一些位點，而這些小的變化使得抗體和抗原結合部位從構象上來說更加契合抗原的三維結構，兩者互補性更趨完善。Yau等[30]也發(fā)現(xiàn)熱點突變對親和力提高可能是通過突變使得可變區(qū)的可溶性和結構方面的物理特性產生了積極的影響，這意味著如果能夠充分了解抗體親和力成熟的過程中真實的結構水平和能量轉化上的改變，就能理性地提出對抗體親和力體外成熟的可控策略。近年來，借助計算機模擬技術，通過同源模建獲取抗體模型，并分析抗原抗體結合活性位點，探究抗原與抗體之間的相互作用，并對抗體的氨基酸序列進行修改，提高抗體親和力，已經成為一種重要的手段[31～35]。

3 展望

分子模擬和計算機輔助抗體進化是當前計算機科學與生物學相結合研究的重要體現(xiàn)，目前該技術運用主要表現(xiàn)在兩個方面：一是用分子動力學模擬方法對抗體進行動態(tài)的模擬，借助計算機理論模型和數(shù)據庫分析，直接從抗體的氨基酸序列預測抗體三維結構以及動力學特征，通過計算模擬抗原和抗體間的分子識別，了解抗體結構與功能的關系；二是通過分子模擬技術充分計算抗原抗體在結合過程中的能量變化，找出二者結合的關鍵位點及重要的能量變化過程，借助抗體數(shù)據庫，通過對關鍵位點的氨基酸的調整，篩選出更加合理的抗體構象，增強抗體的某種屬性[36～38]。

抗體作為醫(yī)藥、食品安全領域等研究領域重要的“原材料”，其重要性不言而喻。但是，基因工程抗體的廣泛應用卻受限于其抗原結合能力不強的問題。值得慶幸的是，基因工程抗體容易在分子和基因水平上進行修飾和改造，這為體外進行抗體親和力成熟提供了可能。另外體外提高抗體親和力的方法實際上都是模仿體內抗體的成熟過程，隨著分子模擬技術的發(fā)展，利用分子對接等手段針對基因工程抗體的序列進行改造將為抗體定向進化提供廣闊的應用前景[39～42]。

通過分子模擬技術對基因工程抗體進行改造僅僅是分子模擬技術運用的一個體現(xiàn)，作為交叉學科的一項重要的技術，分子模擬技術在生物學、物理學及材料學等交叉領域的發(fā)展仍舊需要我們進一步研究和探索[43]。

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