左長清+鐘月春+汪宗桂+戴忠+吳鐵

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的作用及CXCL12、EGFR和CCL2基因表達(dá)的影響。 方法 采用CCK-8法檢測不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2細(xì)胞增殖影響，堿性磷酸酶染色鑒定早期成骨分化，實(shí)時熒光定量PCR法檢測CXCL12、EGFR和CCL2基因的表達(dá)。 結(jié)果 白藜蘆醇在20 μmol/L濃度對C3H10T1/2細(xì)胞增殖沒有影響（P > 0.05），隨著濃度增加，40、80、100 μmol/L的白藜蘆醇明顯抑制細(xì)胞增殖（P < 0.05）。20 μmol/L白藜蘆醇能增強(qiáng)重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）誘導(dǎo)C3H10T1/2的堿性磷酸酶染色。白藜蘆醇對C3H10T1/2細(xì)胞CXCL12、EGFR、CCL2基因表達(dá)沒有明顯影響（P > 0.05）。 結(jié)論 白藜蘆醇能促進(jìn)rhBMP-2誘導(dǎo)成骨分化。促成骨分化作用可能不是通過調(diào)控CXCL12、EGFR和CCL2基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 早期成骨分化；間質(zhì)干細(xì)胞；基因表達(dá)；白藜蘆醇

[中圖分類號] R285；R966 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（c）-0009-04

Effects of resveratrol on early osteoblast differentiation and CXCL12， EGFR and CCL2 gene expression of C3H10T1/2 mesenchymal stem cell

ZUO Changqing1 ZHONG Yuechun1 WANG Zonggui2 DAI Zhong1 WU Tie1

1.Department of Pharmocology， Guangdong Medical College， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.Department of Biochemistry， Guangdong Medical College， Guangdong Province， Dongguan 523808， China

[Abstract] Objective To study the effects of resveratrol on early osteoblast differentiation and mRNA expression of CXCL12， EGFR and CCL2 of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells. Methods The C3H10T1/2 cell proliferation was detected using CCK-8 after different concentrations of resveratrol. The early osteoblast differentiation was identified by alkaline phosphatase （ALP） staining. The mRNA expression of CXCL12， EGFR and CCL2 was detected using real time quantitative RT-PCR. Results The resveratrol less than 20 μmol/L concentrations had no effect on C3H10T1/2 cell proliferation （P > 0.05）， however， high concentrations of resveratrol （40， 80， 100 μmol/L） inhibited the C3H10T1/2 cell proliferation （P < 0.05）. 20 μmol/L resveratrol enhanced rhBMP-2-induced ALP staining of C3H10T1/2 cell， but the gene expressions of CXCL12， EGFR and CCL2 were not changed （P > 0.05）. Conclusion Resveratrol can promote the rhBMP-2-induced osteogenic differentiation， but which may not act through regulating the mRNA expression of Cxcl12， Egfr and Ccl2.

[Key words] Early osteoblastic differentiation； Mesenchymal stem cells； Gene expression； Resveratrol

骨質(zhì)疏松癥是世界范圍內(nèi)的常見病、多發(fā)病。促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞成骨定向分化與成熟是治療骨質(zhì)疏松癥的新的有效手段。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)非黃酮類多酚化合物，具有促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，并抑制間質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化潛能[1]，但白藜蘆醇促成骨分化機(jī)制尚未完全闡明。

間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化是一個非常復(fù)雜的生物過程[2]，涉及到多基因、多信號通路組成的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。筆者前期通過網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)CXCL12、EGFR和CCL2基因在重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)[3]。本文應(yīng)用C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察白藜蘆醇對rhBMP-2促成骨分化作用及對CXCL12、EGFR和CCL2基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠間質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。白藜蘆醇（Sigma），rhBMP-2（Human Zyme），napthol AS-MX phosphate和Fast Blue BB salt（Sigma），TRIzol（Invitrogen），RT-PCR Kit（TaKaRa），CCK-8（Dojindo）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8法檢測藥物對細(xì)胞增殖功能的影響 C3H10T1/2細(xì)胞生長至80%融合，用含0.25%胰酶的消化液消化，制成細(xì)胞懸液，以3000個細(xì)胞/孔接種于96孔板內(nèi)，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后，更換含不同濃度白藜蘆醇（分別為0、5、10、20、40、80、100 μmol/L）的DMEM培養(yǎng)液100 μL，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，以多功能酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處的OD值。按下述公式計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-用藥組平均吸光度/對照組平均吸光度）×100% 。

1.2.2 堿性磷酸酶染色鑒定成骨分化 C3H10T1/2接種于24孔板中，細(xì)胞生長至約90%融合，實(shí)驗(yàn)分為三組：空白對照組、300 ng/mL rhBMP-2組、20 μmol/L白藜蘆醇+ 300 ng/mL rhBMP-2組，每3天更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)成骨誘導(dǎo)分化6 d后，單層細(xì)胞用PBS清洗2次，然后用體積分?jǐn)?shù)為0.70乙醇室溫固定15 min，采用含0.1 mg/mL napthol AS-MX phosphate和 0.6 mg/mL Fast Blue BB salt染色液避光染色30 min，用蒸餾水漂洗細(xì)胞3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR法檢測CXCL12、EGFR和CCLl2 mRNA的表達(dá) C3H10T1/2細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，20 μmol/L白藜蘆醇處理48 h后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，real time PCR檢測CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA的表達(dá)，采用GAPDH基因作為內(nèi)參照，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt表示基因相對表達(dá)水平。

表1 定量RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對細(xì)胞生長的影響

白藜蘆醇在低劑量組（5、10、20 μmol/L）對C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞生長沒有明顯影響，既不能促進(jìn)細(xì)胞生長，同時對細(xì)胞生長也沒有明顯的抑制作用，隨著劑量增大至40 μmol/L時，白藜蘆醇對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，當(dāng)劑量達(dá)到80～100 μmol/L時，生長抑制率達(dá)到84%。表明高劑量的白藜蘆醇具有明顯的細(xì)胞毒性。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 μmol/L白藜蘆醇。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

（x±s，n = 4）

注：與0 μmol/L比較，**P < 0.05；“-”表示基本無抑制，未計(jì)算該數(shù)據(jù)

2.2 白藜蘆醇對rhBMP-2促成骨分化影響

C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化6 d堿性磷酸酶染色顯示：空白對照組細(xì)胞未見藍(lán)紫色；300 ng/mL rhBMP-2組細(xì)胞呈藍(lán)紫色，提示rhBMP-2能誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞早期成骨定向分化；而300 ng/mL rhBMP-2+20 μmol/L白藜蘆醇組ALP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且ALP顏色增深。表明非毒性劑量下，20 μmol/L白藜蘆醇能增強(qiáng)rhBMP-2促成骨分化作用。見圖1。

A：空白對照組；B：300 ng/mL rhBMP-2組；C：300 ng/mL rhBMP-2+ 20 μmol/L白藜蘆醇組

圖1 C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)6 d堿性磷酸酶染色

2.3 白藜蘆醇對CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA表達(dá)的影響

前期筆者通過網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)對rhBMP-2誘導(dǎo)C3H10T1/2成骨分化基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL12、EGFR和CCL2基因在rhBMP-2成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)。為了鑒定白藜蘆醇促成骨分化作用是否通過影響rhBMP-2成骨分化網(wǎng)絡(luò)，本研究用20 μmol/L白藜蘆醇處理C3H10T1/2細(xì)胞48 h后，觀察上述基因表達(dá)水平。結(jié)果表明：白藜蘆醇處理組CXCL12、EGFR和CCL2表達(dá)水平分別為（1.02±0.09）、（1.03±0.05）、（1.10±0.11），與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

3 討論

rhBMP-2是一種被FDA批準(zhǔn)的重要促成骨藥物，目前已在臨床尤其是整形外科領(lǐng)域廣泛使用[4]。眾多研究表明，rhBMP-2具有非常明顯的促進(jìn)間質(zhì)干細(xì)胞、前體成骨細(xì)胞骨向分化作用[5-7]。本研究采用300 ng/mL rhBMP-2作用C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞6 d，ALP染色表明，rhBMP-2能誘導(dǎo)C3H10T1/2間質(zhì)干細(xì)胞早期成骨分化，與前述研究結(jié)果一致。

系統(tǒng)生物網(wǎng)絡(luò)揭示：復(fù)雜疾病不能通過干預(yù)單一靶點(diǎn)而奏效，必須通過干擾疾病生物網(wǎng)絡(luò)多個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。研究藥物干擾疾病網(wǎng)絡(luò)，形成了藥理學(xué)一個新興的分支——網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)或網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)[8-9]。前期筆者通過網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)方法對rhBMP-2誘導(dǎo)C3H10T1/2成骨分化基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL12、EGFR和CCL2基因在rhBMP-2成骨分化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)。目前已經(jīng)證明EGFR信號參與骨原始細(xì)胞群維持、成骨分化平衡調(diào)控[10]，同時與前體成骨細(xì)胞活性和增殖[11]相關(guān)。而CXCL12信號參與骨形成和骨吸收調(diào)控[12]。最近表明BMP-9誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早期和中期，CXCL12信號軸發(fā)揮重要作用[13]。

綜觀目前國內(nèi)外研究進(jìn)展，關(guān)于白藜蘆醇促成骨作用機(jī)制主要涉及到ERK1/2信號通路[14]、WNT信號通路[15]，同時通過激活Sirt1/Runx2[16]或者抑制PPAR2活性，從而抑制干細(xì)胞成脂分化，促進(jìn)成骨分化[1]。但是，間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化涉及到多基因、多信號通路組成的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，白藜蘆醇在整個成骨分化復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)中起到怎樣的調(diào)控作用，目前知之甚少。本研究采用20 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合rhBMP-2作用C3H10T1/2細(xì)胞，結(jié)果表明白藜蘆醇具有促進(jìn)rhBMP-2的成骨誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步分析白藜蘆醇對rhBMP-2成骨分化網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)CXCL12、EGFR和CCL2的影響，結(jié)果表明白藜蘆醇對上述基因表達(dá)沒有明顯的作用。這說明白藜蘆醇促成骨分化作用可能不是通過調(diào)控CXCL12、EGFR和CCL2網(wǎng)絡(luò)接點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。分析原因可能是：①在BMP-2成骨分化網(wǎng)絡(luò)中，存在其他重要節(jié)點(diǎn)，白藜蘆醇可能通過影響其他網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)發(fā)揮作用；②筆者僅僅分析了rhBMP-2促成骨蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，對于rhBMP-2更加復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由于需要更多時間點(diǎn)基因芯片數(shù)據(jù)，沒有進(jìn)行分析；③成骨分化是一個動態(tài)的時續(xù)過程，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)也會根據(jù)分化程度發(fā)生部分時續(xù)改變。

綜上，本研究證明低劑量白藜蘆醇能增強(qiáng)rhBMP-2成骨分化作用，在臨床上，可以聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)療效，同時對白藜蘆醇作用進(jìn)行了初步網(wǎng)絡(luò)分析。隨著研究深入，芯片數(shù)據(jù)量的增加，技術(shù)成熟，可以進(jìn)一步對轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、時續(xù)動態(tài)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步解析白藜蘆醇促成骨分化機(jī)制。

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-05-11 本文編輯：程 銘）