劉 萍 郭海榮 王俊飛 陳軼群 孫 楠

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中卵巢癌又以卵巢上皮癌(EOC)最為多見(jiàn)。在70%的EOC患者中，疾病的進(jìn)展期意味著已發(fā)生了盆腔內(nèi)的廣泛種植轉(zhuǎn)移，而進(jìn)展期EOC患者5年生存率仍不到25%。目前EOC患者的預(yù)后判斷多基于臨床病理參數(shù)，然而報(bào)告顯示在相同病期、相同組織類型或分化級(jí)別的患者中，腫瘤的生物學(xué)方式和預(yù)后常常不同。因而，確定新的預(yù)后因素以便區(qū)分不同結(jié)果的患者可能對(duì)改善治療有幫助。

CD105 是內(nèi)皮細(xì)胞增生的最可靠的標(biāo)記物[1]，Ki-67是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)記之一[2]。目前同時(shí)研究CD105、Ki67在EOC中聯(lián)合表達(dá)對(duì)于預(yù)后價(jià)值的報(bào)告還很少。本研究采用免疫組化法對(duì)我院166例ECO組織中CD105和Ki67的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在明確它們?cè)贓CO侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2002年1月至2011年12月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為EOC患者共166例，年齡39～81歲，中位年齡為54歲。復(fù)習(xí)家族史確認(rèn)患者為散發(fā)病例，且均為初發(fā)。根據(jù)2000年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)診斷標(biāo)準(zhǔn)中卵巢惡性腫瘤臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期:Ⅰ期16例，Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期108例。組織學(xué)分化:高分化 24 例，中分化 52例，低分化 90 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 98 例。

1.2 治療方法

患者均采用以手術(shù)為主的綜合治療，入院后行常規(guī)術(shù)前檢查后行全子宮加雙側(cè)附件切除術(shù)，其中150例行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及盆腔和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)清掃術(shù)，清掃盆腔淋巴結(jié)19～34枚。根據(jù)患者年齡、腫瘤臨床分期、病理及免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果確定下一步治療方案。

1.3 組織病理學(xué)檢測(cè)

將術(shù)中切除組織用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度為4 mm)后行蘇木精一伊紅染色。按照世界衛(wèi)生組織卵巢腫瘤組織學(xué)類型分類標(biāo)準(zhǔn)，在顯微鏡下觀察并確認(rèn):漿液性腺癌122例，黏液性囊腺癌26例，勃液性腺癌7例，內(nèi)膜樣腺癌9例，透明細(xì)胞癌2例。

1.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)

1.4.1 主要試劑 鼠抗人Ki67單克隆抗體(Changdao公司，美國(guó))，鼠抗人P53單克隆抗體(Sunbio公司，中國(guó))，免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白---過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑。免疫組織化學(xué)檢測(cè)，根據(jù)Envision二步法的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) CD105表達(dá)主要分布于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，Ki67 表達(dá)主要于細(xì)胞核，均以出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒且染色強(qiáng)度明顯高于背景者為陽(yáng)性表達(dá)。CD105和Ki67蛋白表達(dá)以高倍光學(xué)顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的平均值表示，陽(yáng)性細(xì)胞率 <5%為 0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2 分，51%～75%為 3分，>75%為 4 分；染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)：無(wú)著色或著色很弱為0分；淡棕黃色為 1 分；棕黃色為 2 分；深棕黃色為 3 分。上述兩項(xiàng)積分相加為最后結(jié)果：0 分為陰性(-)，1～3 分為弱陽(yáng)性(+)，4～5 分為中等陽(yáng)性(++)，>6 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 隨訪

總生存期(OS)定義為從治療開(kāi)始日至死亡或隨訪截止日期。隨訪截至于2011年12月31日，中位隨訪時(shí)間為26.3個(gè)月。所有病例均未失訪，至隨訪結(jié)束48例患者仍存活。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定性資料間的比較采用卡方檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，生存曲線采用Kaplan-Meier 法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 CD105和Ki67表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的關(guān)系

組織學(xué)分化低EOC患者CD105和Ki67蛋白表達(dá)率顯著高于組織學(xué)分化高患者(P<0.05);Ⅲ～Ⅳ期患者CD105和Ki67蛋白表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CD105和Ki67表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 166例卵巢上皮癌組織中CD105和Ki67表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

注：△為與低分化比較；#為與Ⅲ～Ⅳ期比較。

2.2 CD105 與Ki67 表達(dá)相關(guān)性分析

166 例卵巢上皮癌中，CD105 和Ki67 同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)共86例(51.8%)，同時(shí)呈陰性表達(dá)共16例(9.6%)，CD105 陽(yáng)性表達(dá)、Ki67 陰性表達(dá)共126例(75.9%)，CD105陰性表達(dá)、Ki67 陽(yáng)性表達(dá)共110例(66.3%)。經(jīng)Spearman 等級(jí)相關(guān)分析顯示，在卵巢上皮癌中CD105與Ki67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.66，P=0.01)。

2.3 CD105 和 Ki67表達(dá)與卵巢上皮癌預(yù)后的單因素分析(表2)

表2 ECO患者預(yù)后單因素分析結(jié)果

Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，EOC患者OS與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，CD105+/ Ki67+患者OS顯著縮短，CD105-/Ki67-患者OS延長(zhǎng)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

CD105是受體TGF-β(腫瘤生長(zhǎng)因子)家族成員，是內(nèi)皮細(xì)胞增生的最可靠的標(biāo)記物，在癌灶內(nèi)及癌灶瘤周高表達(dá)，提示其在新血管生成的血管優(yōu)先表達(dá)[3]。目前國(guó)內(nèi)外主要集中在研究腫瘤中CD105作為血管形成分子的角色和它作為腫瘤中微血管密度標(biāo)記的作用。Ki67是細(xì)胞周期G1期的一個(gè)核蛋白，出現(xiàn)在細(xì)胞周期的全部活躍階段(G1、S、G2)，但不在休眠期細(xì)胞出現(xiàn)(G0)，其表達(dá)與細(xì)胞增生相關(guān)。是目前檢測(cè)腫瘤增殖活性和增殖速率最可靠的指標(biāo)[4]。細(xì)胞增殖活性與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，而Ki67蛋白的表達(dá)對(duì)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖狀態(tài)、研究腫瘤的生物學(xué)行為及評(píng)估患者預(yù)后也具有重要意義[5]。研究顯示Ki67增生指數(shù)同一些癌癥不良的遠(yuǎn)期無(wú)病存活和總體存活相關(guān)[6]。Ki67蛋白表達(dá)對(duì)腫瘤預(yù)后的影響及同腫瘤臨床病理特征的關(guān)系提示在多種不同種類的癌癥中起到重要作用。國(guó)外有研究表明在卵巢癌中Ki67的細(xì)胞核表達(dá)>30%預(yù)示在進(jìn)展期卵巢癌中呈高表達(dá)[7]。然而，同時(shí)研究CD105、Ki67在卵巢上皮癌中聯(lián)合表達(dá)對(duì)于預(yù)后的價(jià)值的報(bào)告還很少。

國(guó)內(nèi)已有研究發(fā)現(xiàn)，EOC中 Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌的Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，與本研究的結(jié)果一致。目前對(duì)于頭頸部、前列腺等多個(gè)部位腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，Ki67蛋白的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并推測(cè)Ki67蛋白可作為一個(gè)獨(dú)立的腫瘤特異性的標(biāo)志[8]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的CD105、Ki67蛋白表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，表明CD105、Ki67蛋白的高表達(dá)能較可靠地反映腫瘤增殖活性和速度，其表達(dá)水平越高，表明腫瘤細(xì)胞增殖越快，越易發(fā)生侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示，CD105、Ki67蛋白可作為EOC分級(jí)、分期及判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)，有助于臨床醫(yī)師選擇腫瘤的治療方法及評(píng)估療效和預(yù)后。

免疫組化法分析166例卵巢上皮癌組織中CD105和Ki67的表達(dá)。結(jié)果可見(jiàn)CD105的陽(yáng)性染色126例(75.9%)，Ki67陽(yáng)性表達(dá)為110例(66.3%)，同一腫瘤樣本里CD105、Ki67兩個(gè)都表達(dá)的為86/166(51.8%)，且CD105和Ki67表達(dá)明顯相關(guān)(Spearman's相關(guān)指數(shù)γ=0.66,P=0.01，P<0.05)。CD105 在病理分級(jí)高的腫瘤中過(guò)表達(dá)，Ki67在進(jìn)展期腫瘤中過(guò)表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)提示CD105 和Ki67可作為浸潤(rùn)性腫瘤的生物標(biāo)記物，并預(yù)示患者的不良預(yù)后。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)CD105、Ki67在卵巢癌中過(guò)表達(dá)與總體不良預(yù)后成正相關(guān)。

我們的研究結(jié)果表明，F(xiàn)IGO分期和腫瘤分級(jí)與患者總體存活率顯著相關(guān)，CD105 和Ki67表達(dá)與較短的總體生存時(shí)間顯著相關(guān)，且兩者表達(dá)在ECO患者的總體生存中為獨(dú)立的預(yù)后因素。

同樣，我們分析了卵巢上皮癌中CD105/Ki67聯(lián)合表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。在CD105/Ki67聯(lián)合表達(dá)的四個(gè)不同狀態(tài)發(fā)現(xiàn)了顯著不同的預(yù)后，對(duì)CD105-/Ki67-相對(duì)有最好的預(yù)后，而CD105+/Ki67+患者顯示出最差的預(yù)后。在預(yù)測(cè)卵巢上皮癌的轉(zhuǎn)歸中，CD105/Ki67聯(lián)合表達(dá)對(duì)于獨(dú)立CD105或 Ki67具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果提示CD105、Ki67 蛋白表達(dá)可能涉及卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展。CD105和Ki67 聯(lián)合表達(dá)可能對(duì)于卵巢上皮癌預(yù)后的評(píng)估有所幫助。

[1] Miyahara M,Tanuma J,Sugihara K,et al.Tumor lymphangiogenesis correlates with lymph node metastasis and clinicopathologic parametem in oral squamous cell carcinoma〔J〕.Cancer,2007,110(6):1287-1294.

[2] Zhu C,Luo J,Shi H,et al.Expression of tubulin,p53,ki67,receptors for estrogen,and progesterone in endometrial cancer〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol,2009,30(5):514-517.

[3] Gromova P,Rubin BP,Thys A,et al.ENDOGLIN/CD105 is expressed in KIT positive cells in the gut and in gastrointestinal stromal tumors〔J〕.J Cell Mol Med,2012,16(2):306-317.

[4] Santisteban M,Reynolds C,Barr Fritcher EG,et al.Ki67:a time-varying biomarker of risk of breast cancer in atypical hyperplasia〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2010,121(2):431-437.

[5] Zellweger T,Günther S,Zlobec I,et al.Tumour growth fraction measured by immunohistochemical staining of Ki67 is an independent prognostic factor in preoperative prostate biopsies with small-volume or low-grade prostate cancer〔J〕.Int J Cancer,2009,124(9):2116-2123.

[6] Munstedt K,von Gorgi R,Franke FE.Correlation between -

MIBI-detennined tumor grouth fraction and incidece of tumor Recurrence in early orarian careinomas〔J〕.Cancer Invest,2004,22(2):185-194.

[7] Surowiak P,Matern V,Kaplenko I,et al.Topoisomerase IA,HER/2neu and Ki67 expression in paired primary and relapse ovarian cancer tissue sample〔J〕.Histol Histopathology,2006,21(7):713-720.

[8] Romero Q,Bendahl PO,Klintman M,et al.Ki67 proliferation in core biopsies versus surgical samples-a model for neo-adjuvant breast cancer studies〔J〕.BMC Cancer,2011,11:341.