江慶萍 謝思明 王 爽 儲 兵 姚開泰

腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中都起著至關(guān)重要的作用，所以在腫瘤研究中是不可回避的關(guān)鍵問題。2007年，Wang等[4]用免疫熒光法檢測CK8、CK18和CK19在SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CK8和CK18在兩種細(xì)胞中均強(qiáng)表達(dá)，而CK19只在SP細(xì)胞中有14.5%的表達(dá)，非SP細(xì)胞中未見表達(dá)，據(jù)此作者認(rèn)為CK19是鼻咽癌干細(xì)胞一個潛在的重要分子標(biāo)志，并被各類文獻(xiàn)引用。而CD133被作為多種腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)志物為大家所熟知。本文將通過檢測CK19、CD133在正常鼻咽黏膜、鼻咽癌組織、永生化和鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá)，進(jìn)一步確定鼻咽癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料

選取廣東省中山市人民醫(yī)院病理科附有正常黏膜和非典型增生的鼻咽癌組織標(biāo)本39例，其中男性19例，女性20例，年齡23～73歲，并另選取11例正常鼻咽黏膜上皮組織作為對照。細(xì)胞株：5-8F、6-10B，低分化鼻咽癌細(xì)胞系，由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所建立，生長培基為PRMI1640+10%FCS，細(xì)胞呈上皮樣、貼壁生長，具有高成瘤和高轉(zhuǎn)移能力。CNE2:低分化鼻咽癌細(xì)胞系，南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所建立，生長培基為PRMI1640+10%FCS，細(xì)胞呈上皮樣、貼壁生長。NP69:鼻咽永生化細(xì)胞系，由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所建立，生長培基為Keratinocyte-SFM(GIBCO)，細(xì)胞呈上皮樣、貼壁生長?？贵w：CD133/1(AC133)單克隆抗體購自德國Miltenyi公司，CK19(GM088801)、CK14(LL002)為中國福州邁新公司產(chǎn)品，CK8(35βH11)、CK18(DC10) 購于美國KAKO公司。免疫組化SP試劑盒、DAB染色試劑盒均為中國福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。裸鼠：BALB/c-nude裸鼠，4～6周齡，雌性，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，等級為無特定病原體動物(specific pathogen-free animals，SPF)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠體內(nèi)成瘤 5-8F、6-10B和CNE2細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，以1×106個細(xì)胞分別注入2只裸鼠雙側(cè)腋下，觀察成瘤情況。8周后，取出瘤塊，固定、石蠟包埋并切片。

1.2.2 免疫組化SP 按試劑說明書進(jìn)行，微波修復(fù)10 min，CD133抗體稀釋濃度為1∶50；DAB顯色；中性樹膠封片。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法 潔凈玻片高壓消毒，滴上細(xì)胞，培養(yǎng)24 h細(xì)胞完全爬片后終止培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)為SP法，按試劑說明書進(jìn)行，CD133抗體稀釋濃度為1∶50；DAB顯色；中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化結(jié)果判斷方法 按細(xì)胞著色評分：棕褐色 3分；棕黃色 2分；淡黃色 1分；無著色 0分。按陽性細(xì)胞數(shù)評分：一個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)>75% 為4分；51%～75%為3分；11%～50%為2分；1%～10% 為1分；無陽性細(xì)胞為0分。上述兩項得分相乘為最后結(jié)果，3分為“+”；4分為“++”； 5分以上為“+++”?！?～+++”為陽性表達(dá)。

1.2.5 PCR檢測3種癌細(xì)胞株中CD133基因 提取5-8F、6-10B和CNE2的RNA，對經(jīng)檢測完好的RNA進(jìn)

行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照PrimeScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：10×buffer 1μl，Taq酶0.15 μl；dNTP 0.8 μl；上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，cDNA 0.5 μl，H2O 7.15 μl，總體積 10 μl。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 s；然后為93 ℃ 10 s、51 ℃ 10 s、72 ℃ 5 s，30個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。取5 μl 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳以檢測CD133基因是否存在。

2 結(jié)果

2.1 CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎組中的表達(dá)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK19在大部分鼻咽癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)(37/39，67.2%)。黏膜慢性炎柱狀上皮中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，化生鱗狀上皮中呈陽性表達(dá)。

2.2 CK19在鼻咽癌細(xì)胞株及其裸鼠移植瘤中的表達(dá)

檢測了CK19在5-8F、6-10B和CNE2裸鼠移植瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK19在3種移植瘤中都有散在點巢狀陽性。CK19在5-8F、6-10B和CNE2 3個細(xì)胞株中均呈陰性表達(dá)。

2.3 免疫組化檢測鼻咽癌組織中CD133表達(dá)

39例鼻咽癌組織中8例僅有個別癌巢的邊緣見散在CD133+細(xì)胞，2例黏膜上皮主要是基底部細(xì)胞CD133呈陽性。11例鼻咽黏膜組織中未見CD133陽性細(xì)胞。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測永生化細(xì)胞株NP69和癌細(xì)胞株中CD133表達(dá)情況

鼻咽永生化細(xì)胞株NP69中見散在的CD133+細(xì)胞，在10個高倍視野下陽性細(xì)胞率平均為1.5%。但3種癌細(xì)胞株5-8F、6-10B和CNE2細(xì)胞爬片連續(xù)6次免疫細(xì)胞化學(xué)檢測均未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞，考慮原因可能是在這些細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞含量很低或者CD133表達(dá)很弱，導(dǎo)致在細(xì)胞爬片這種有限的細(xì)胞數(shù)量中難以檢出，故進(jìn)一步采用PCR法驗證這3種癌細(xì)胞株中是否有CD133基因表達(dá)。

2.5 PCR檢測3種鼻咽癌細(xì)胞株中CD133的存在

5-8F、6-10B和CNE2細(xì)胞分別提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行CD133基因PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)兩次。1%凝膠電泳結(jié)果兩次完全一致，結(jié)果顯示100～200 bp間CD133基因在3個細(xì)胞株均有清晰的條帶(圖1)。

1為5-8F-GAPDH;2為5-8F-CD33;3為 6-10B-GAPDH;4為6-10B-CD133;5為CNE2-GAPDH;6為CNE2-CD133。

圖1 凝膠電泳檢測CNE2、6-10B和5-8F鼻咽
癌細(xì)胞株中CD133表達(dá)

3 討論

3.1 CK19的表達(dá)特征及能否作為NPC干細(xì)胞標(biāo)志物的分析

上皮組織因為有上皮特有的角蛋白表達(dá)，人們通常在研究上皮組織正常和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物時常試圖尋找是否有角蛋白標(biāo)志物。1996年，Michel等[1]證實了CK19為皮膚干細(xì)胞標(biāo)記物。2001年，Collins[2]發(fā)現(xiàn)前列腺干細(xì)胞表達(dá)α2β1和CK5及CK14。2006年，Ricci-Vitiani等[3]證明結(jié)腸癌干細(xì)胞CD133+CK20-。2007年，Wang等[4]用免疫熒光法檢測CK8、CK18和CK19在SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CK8和CK18在2種細(xì)胞中均強(qiáng)表達(dá)，而CK19只在SP細(xì)胞中有14.5%的表達(dá)，認(rèn)為CK19是鼻咽癌干細(xì)胞一個潛在的重要分子標(biāo)志。但我們的試驗結(jié)果讓我們對CK19是否為鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物提出了疑問。在對鼻咽癌組織、細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤和細(xì)胞株進(jìn)行CK19檢測時發(fā)現(xiàn)，雖然CK19在3個細(xì)胞株5-8F、6-10B和CNE2中幾乎沒有見到陽性細(xì)胞表達(dá)，但3個細(xì)胞株移植瘤中CK19呈灶性或散在表達(dá)，鼻咽癌標(biāo)本中67.2%的癌組織更呈彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)，黏膜慢性炎和鼻咽癌癌旁腺上皮均陽性，部分化生鱗狀上皮也陽性。根據(jù)干細(xì)胞概念，它們是一群稀少的保持?jǐn)?shù)量恒定和具有自我更新能力的細(xì)胞，而在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎中CK19如此廣泛地表達(dá)，我們認(rèn)為把它作為干細(xì)胞標(biāo)志物是不恰當(dāng)?shù)?。它在?xì)胞株、裸鼠移植瘤和鼻咽癌以及黏膜慢性炎組織中的表達(dá)水平不同可能與細(xì)胞所處微環(huán)境有關(guān)，而非因為是干細(xì)胞標(biāo)志物。

3.2 CD133分布特性及作為鼻咽干細(xì)胞標(biāo)志物可能性研究

Prominin-1(別名CD133，AC133) 分子是1個有5個跨膜域的獨(dú)特糖蛋白,它最早于1997年在小鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并因為它在細(xì)胞膜上明顯的突出定位被命名為Prominin-1[5]。在多細(xì)胞生物中Prominin-1普遍表達(dá)，分布廣泛。在小鼠Prominin-1發(fā)現(xiàn)的同年，Yin等[6]從胎兒肝臟，骨髓和臍帶血中分離出的CD34+造血干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了Prominin-1人類同系物AC133(CD133)。后來，人們在造血系統(tǒng)外的不同器官和組織中都相繼發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞具有干細(xì)胞功能。VEGF-R2+的內(nèi)皮組細(xì)胞上CD133陽性表達(dá)，隨著這些細(xì)胞的成熟，CD133表達(dá)迅速減弱[7]。

不僅在正常間葉和上皮組織中人們發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞具有干細(xì)胞的功能，在腫瘤組織中人們也發(fā)現(xiàn)多種腫瘤干細(xì)胞即“腫瘤干細(xì)胞”表達(dá)CD133。如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌等[8-10]。那么，CD133是否也是鼻咽組織和癌細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志呢？目前相關(guān)文獻(xiàn)研究很少。

本實驗首先利用免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)觀察鼻咽黏膜慢性炎標(biāo)本和附有不典型增生的鼻咽癌組織CD133以及黏膜正常上皮細(xì)胞、永生化細(xì)胞和癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，從而了解CD133是否有成為鼻咽干細(xì)胞標(biāo)志物的可能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在39例鼻咽癌中有8例在散在癌巢邊緣區(qū)域見有散在CD133陽性細(xì)胞分布，2例鼻咽上皮基底部陽性，11例黏膜慢性炎均陰性。從結(jié)果分析，雖然39例癌組織只有8例有陽性，但因為鼻咽部局限，并且取材標(biāo)本只有數(shù)毫米大小，只占癌組織的極個別部位，所以不能認(rèn)為其他31例沒有CD133陽性細(xì)胞。從以往關(guān)于其他腫瘤和正常組織中干細(xì)胞分布位置和數(shù)量的研究[11-12]以及本作者LRCs的探討中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞常分布于癌巢邊緣和上皮基底部，并且數(shù)量稀少，我們的免疫組化結(jié)果同此特征相符合，從而從組織學(xué)角度證明CD133可以假設(shè)為鼻咽干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行以后的分離和特性鑒定試驗。

永生化細(xì)胞株NP69及鼻咽癌細(xì)胞株免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，NP69有散在的CD133+細(xì)胞存在,其中后者十個高倍視野下有1.5%，而鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B和CNE2重復(fù)數(shù)次均未檢測到CD133表達(dá)。我們把3種癌細(xì)胞行qRT-PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示5-8F、CNE2和6-10B均見明顯清晰的條帶。綜上所述，我們認(rèn)為CD133可能是鼻咽正常和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。2013年，也有學(xué)者證實CD133為鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)記物[13]。

根據(jù)CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎標(biāo)本、鼻咽癌細(xì)胞株移植瘤和細(xì)胞株中的表達(dá)情況，提出CK19并非為鼻咽癌干細(xì)胞標(biāo)志物，它表達(dá)的不同可能與癌細(xì)胞所處微環(huán)境不同有關(guān)。從組織和細(xì)胞學(xué)水平上觀察，我們認(rèn)為CD133是鼻咽癌可能干細(xì)胞標(biāo)志物，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

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