王 藝 陳金石 李隆玉 李 凌

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其中宮頸鱗癌約占80%～90%。雖然目前對于宮頸鱗癌的治療效果取得了顯著進(jìn)步，但晚期及復(fù)發(fā)性宮頸鱗癌患者治療效果及預(yù)后卻不夠理想。隨著惡性腫瘤多學(xué)科綜合治療模式的轉(zhuǎn)變，基因治療倍受矚目。因此，探索宮頸鱗癌基因治療具有重大意義。本研究將hTERT SiRNA導(dǎo)入耐藥宮頸鱗癌SiHa/DDP細(xì)胞株后，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測hTERT mRNA含量、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、MTT法檢測細(xì)胞凋亡變化，并將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸鱗癌耐藥細(xì)胞株SiHa/DDP：由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院遺傳實(shí)驗(yàn)室劉珊玲教授惠贈。hTERT SiRNA由Invitrogen公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成 目的基因hTERT及內(nèi)參照基因的PCR引物采用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件，并經(jīng)GeneBank Blast進(jìn)行同源性比較，確定其特異性，引物序列：hTERT上游引物，5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’；GAPDH上游引物，5’-CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’。由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對照組(A組)，脂質(zhì)體對照組(B組)，Negative Control siRNA對照組(C組)，轉(zhuǎn)染組(D組)[hTERT SiRNA與脂質(zhì)體混合液轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞組(熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞hTERT mRNA實(shí)驗(yàn)時，該組有SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3小組)]。不同時間點(diǎn)收集各組細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測，重復(fù)3次，每個指標(biāo)檢測設(shè)置3復(fù)孔。

1.2.3 SiHa/DDP細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每毫升加2微克順鉑的混合液，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 設(shè)計(jì)并化學(xué)合成hTERT siRNA 根據(jù)Genebank中的hTERT基因序列，遵守siRNA設(shè)計(jì)原則并參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了三對長度均為21bp的siRNA鏈，并由美國Invitrogen公司上海分部協(xié)助合成，Negative Control siRNA正義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。SiRNA-1正義鏈，5’-GGAGCAAGUUGCAAAGCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGCUUUGCAACUUGCUCCTT-3’。SiRNA-2正義鏈，5’-GGAACACCAAGAAGUUCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGAACUUCUUGGUGUUCCTT-3’。SiRNA-3正義鏈，5’-GCACCAACAUCUACAAGAUTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。序列經(jīng)檢索證實(shí)與其它基因無同源性，siRNA帶有綠色熒光蛋白作標(biāo)記。

1.2.5 hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)步驟如下：①種板：轉(zhuǎn)染前一天，以(4～6)×105/孔的密度將細(xì)胞轉(zhuǎn)種到6孔板中，加入1 ml無抗生素培養(yǎng)基，并保證轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度為70%～85%。② hTERT siRNA和脂質(zhì)體的配置：依照轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染當(dāng)天用EP管把干粉裝10 OD siRNA離心→加300 μlDEPC水(獲得10 μM濃度siRNA300 μl，此時10 μlsiRNA溶液含siRNA100 pmol)→加120 μl ployfectine轉(zhuǎn)染試劑輕輕搖晃混勻，室溫靜置15 min。③孵育siRNA脂質(zhì)體溶液同時用無血清培養(yǎng)基洗滌待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞3次，然后于每孔中加入1.0 ml無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。siRNA脂質(zhì)體溶液孵育15 min后，轉(zhuǎn)移至6孔板中，輕輕搖動，置培養(yǎng)箱孵育5 h后更換完全培養(yǎng)基。24 h后取出6孔板，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白估計(jì)轉(zhuǎn)染效率，選擇熒光監(jiān)測效果明顯的處理孔完成后面實(shí)驗(yàn)。

1.3 hTERT mRNA含量檢測

試劑盒購于美國Invitrogen公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程：總RNA的提取，然后去除基因組DNA，再行逆轉(zhuǎn)錄，然后采用Real-time PCR檢測hTERT mRNA含量，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三對長度均為21bp的siRNA鏈 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并檢測各轉(zhuǎn)染組hTERT mRNA表達(dá)，然后選取對hTERT mRNA表達(dá)抑制效果最明顯的siRNA鏈(siRNA-1)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞分散于200 ml的PBS緩沖液中，用4 ℃預(yù)冷的PBS分別洗滌待檢測細(xì)胞兩次，用吸管吸盡PBS。加入2 ml預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定細(xì)胞抗原；250 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移懸液至EP管，用100 μL Binding Buffer充分潤洗六孔板殘留細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管，往EP管加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI，混勻后避光，室溫反應(yīng)20 min，加PBS400 μL稀釋細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(5～6)×105/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測分析，通過軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 MTT法檢測hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染后SiHa/DDP細(xì)胞生長抑制變化

選取貼壁80%～90%的六孔板，消化。各處理組細(xì)胞懸液分別以100 μL接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔；同時設(shè)調(diào)零孔和細(xì)胞對照孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱。于24 h、48 h、72 h 3個時間，于每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，于每孔中加入200 μL DMSO終止反應(yīng)。室溫下置于搖床振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測OD值。應(yīng)用作圖軟件OD值為縱坐標(biāo)，以時間(h)為橫坐標(biāo)繪制生長抑制曲線,觀測hTERT siRNA對宮頸癌耐藥細(xì)胞株SiHa/DDP的生長抑制效果。

1.6 結(jié)果判定

轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后提取各處理組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，由系統(tǒng)自動記錄熒光曲線并分析計(jì)算出Ct值。計(jì)算方式：△Ct=Ct(hTERT)-Ct(hGAPDH)，△△Ct =(樣品Ct值-內(nèi)參照Ct值)-(對照組樣品Ct值-對照組內(nèi)參照Ct值)，然后取2-△△Ct代表被檢樣品初始hTERT mRNA含量。MTT設(shè)置酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測細(xì)胞OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 觀察熒光細(xì)胞

熒光顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無熒光，而轉(zhuǎn)染的SiHa/DDP細(xì)胞可見有綠色熒光。

2.2 轉(zhuǎn)染后hTERT mRNA表達(dá)水平的檢測

2.2.1 不同siRNA對SiHa/DDP細(xì)胞hTERT表達(dá)水平的抑制作用 hTERT siRNA轉(zhuǎn)染SiHa/DDP細(xì)胞24 h后，實(shí)時熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞hTERT mRNA，結(jié)果siRNA-1、siRNA-2和SiRNA-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)量均顯著下降:設(shè)定空白對照組為1，其各組細(xì)胞hTERT mRNA相對表達(dá)量(即拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值)均值分別為：SiRNA-1組(0.249±0.019)、SiRNA-2組(0.273±0.028)、SiRNA-3組(0.350±0.017)、Negative Control siRNA組(0.931±0.036)、脂質(zhì)體對照組(0.956±0.052)(圖1)。單因素方差分析結(jié)果顯示：SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對表達(dá)量分別與Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體組及空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SiRNA-1組hTERT mRNA相對表達(dá)量與SiRNA-2組、SiRNA-3組相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體對照組及空白對照組相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可見SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對表達(dá)量較各未轉(zhuǎn)染對照組均明顯下降，說明3個構(gòu)建的SiRNA片段均有良好抑制效果，三組片段間無明顯差異，選取對hTERT mRNA表達(dá)抑制效果最強(qiáng)的siRNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)染組及各對照組hTERT mRNA相對表達(dá)量

2.2.2 siRNA-1對SiHa/DDP細(xì)胞hTERT表達(dá)水平的抑制作用 轉(zhuǎn)染48 h及72 h后繼續(xù)檢測siRNA-1轉(zhuǎn)染組、Negative Control siRNA組、脂質(zhì)體組及空白對照組hTERT mRNA含量。同理用2-△△Ct公式計(jì)算被檢樣品hTERT mRNA含量，其他各組細(xì)胞hTERT mRNA相對表達(dá)量均值與空白對照組比較，48 h分別為：siRNA-1組(0.138±0.009)，Negative Control siRNA組(0.940±0.025)，脂質(zhì)體組(0.961±0.037)，siRNA-1組hTERT mRNA相對表達(dá)量與各對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。72 h分別為：siRNA-1組(0.174±0.016)，Negative Control siRNA組(0.901±0.042)，脂質(zhì)體組(0.943±0.28)；siRNA-1組hTERT mRNA相對表達(dá)量與各對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？梢妔iRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的hTERT mRNA表達(dá)量下降顯著，見圖2。

圖2 siRNA-1組及對照組hTERT mRNA相對表達(dá)量

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。轉(zhuǎn)染24 h后hTRET siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡率為(75.83±2.18)%,與A組[(0.18±0.07)%]比較有顯著差異，而轉(zhuǎn)染48 h時轉(zhuǎn)染組凋亡率增高至(86.48±7.18)%，轉(zhuǎn)染72 h凋亡率較48 h下降(83.41±5.81)%。比較轉(zhuǎn)染24 h各組早期細(xì)胞凋亡率：siRNA-1組[(75.83±2.18)%]明顯高于C組[(2.11±0.08)%]、B組[(0.32±1.22)%]和A組[(0.18±0.07)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；hTRET siRNA轉(zhuǎn)染組壞死細(xì)胞和晚期細(xì)胞凋亡率[(18.02±2.71)%]同樣明顯高于C組[(2.03±0.10)%]、B組[(0.36±1.02)%]和A組[(0.08±0.02)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 MTT法檢測hTERT SiRNA轉(zhuǎn)染后SiHa/DDP細(xì)胞生長曲線

轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后分別采用MTT比色法檢測各組SiHa/DDP細(xì)胞OD490均值：siRNA-1組分別為(0.103±0.006)、(0.080±0.004)、(0.032±0.0006)；空白細(xì)胞對照組分別為(0.118±0.008)、(0.151±0.005)、(0.190±0.003)；脂質(zhì)體對照組分別為(0.111±0.006)、(0.143±0.003)、(0.179±0.001)，Negative Control siRNA對照組分別為(0.110±0.004)、(0.127±0.004)、(0.168±0.005)；同一時間點(diǎn)各組OD490均值單因素方差分析比較，siRNA-1組明顯低于其余3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以O(shè)D490均值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，見圖3。

3 討論

端粒酶是1種RNA蛋白復(fù)合體，由三個部分組成：端粒酶自身RNA模板、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TRET)、端粒酶相關(guān)蛋白，其以自身的RNA為模板合成端粒重復(fù)序列使端粒長度得以維持[1]，而人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,hTERT)是其活性表達(dá)的關(guān)鍵組份和限速因子[2]。端粒的主要功能是在染色體末端形成帽子結(jié)構(gòu)，使染色體不會隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，也使染色體末端無有害融合，從而維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性。Zheng等[3]研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變時端粒酶被激活，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)時即可檢測到端粒酶的表達(dá),而宮頸癌時激活程度更高,發(fā)現(xiàn)端粒酶激活概率隨宮頸癌病變進(jìn)展而升高，并認(rèn)為TERC基因擴(kuò)增檢測可以提供一個有效的非侵入性的方法用來評估鑒別宮頸疾病病變級別高低。Jin等[4]采用液基薄層原位雜交(FISH)細(xì)胞病理學(xué)檢查和檢測擴(kuò)增的熒光在130多名婦女進(jìn)行人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測、陰道鏡活檢和組織病理學(xué)檢查。結(jié)果人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測、陰道鏡活檢和組織病理學(xué)檢查均顯示在宮頸高度鱗狀上皮病變患者中hTERC基因擴(kuò)增率高于宮頸高度鱗狀上皮病變患者。并認(rèn)為FISH檢測hTERC基因擴(kuò)增可能是區(qū)分低級別和高級別的宮頸鱗狀細(xì)胞疾病的診斷的一種有效的輔助細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)檢查。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在宮頸癌組織中hTERT mRNA高表達(dá)與端粒酶激活關(guān)系密切，對宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性檢測或hTERT mRNA異常高水平表達(dá)，既可當(dāng)作早期診斷宮頸癌的一個標(biāo)志，還可以輔助判斷宮頸病變級別高低。

圖3 hTRET SiRNA-1對SiHa/DDP細(xì)胞體外增殖的抑制作用

我們先期有相關(guān)研究[5]針對江西省2499例30～49歲農(nóng)村婦女進(jìn)行了以病理為金標(biāo)準(zhǔn)的宮頸癌篩查發(fā)現(xiàn)在CINⅡ及以上病變hTERC基因擴(kuò)增明顯；且隨著宮頸病變程度的增加,hTERC基因表達(dá)率增加。由此可見，hTERC基因異常的染色體不穩(wěn)定性與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切?？梢奾TERT與宮頸癌密切關(guān)系，但通過hTERT SiRNA手段對宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡實(shí)際效果的細(xì)胞及分子水平的研究報(bào)道較少。hTERT作為端粒酶的關(guān)鍵組分維持端粒長度，能直接參與腫瘤細(xì)胞增殖和生長的調(diào)控，它的表達(dá)受多個水平多個因子精密調(diào)控，與宮頸鱗癌的臨床病理指標(biāo)具有相關(guān)性，是宮頸癌基因干擾實(shí)驗(yàn)的良好靶基因。通過有效siRNA片段抑制hTERT表達(dá)能抑制細(xì)胞生長增殖并促進(jìn)凋亡，至于siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞后作用場所這點(diǎn)目前尚無定論，有研究支持是在細(xì)胞核內(nèi)作用[6]，有研究認(rèn)為其限于在細(xì)胞漿作用[7]，具體明確還待進(jìn)一步研究。

靶向RNA干擾對腫瘤的端粒酶的抑制作用是一個多階段、多因素的復(fù)雜過程，目前端粒酶分子機(jī)制尚未被完全明確。此外，端粒的延長也還存在著不依靠端粒端粒酶活性的方式。因此可以推測不可能所有類型的腫瘤對端粒酶抑制劑產(chǎn)生良好的抑制反應(yīng)。而且在細(xì)胞周期的不同階段的端粒酶活性各不相同，如何在不同的階段的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有針對性的抗端粒酶治療，這也仍然是一個問題。已有的靶向治療端粒酶研究多針對體外各種細(xì)胞系的，動物模型研究相對缺乏，因此建立合適的動物模型進(jìn)行研究是一個迫切的問題。目前的RNAi靶向端粒酶大部分主要是抑制端粒酶的單個組件，因此這不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，隨后的RNA干擾技術(shù)的研究應(yīng)該考慮利用同一基因家族的多個基因有的同源片段，因?yàn)榇似斡懈叨缺Ｊ氐奶匦?，所以如果成功設(shè)計(jì)出有效的同源序列的siRNA分子片段，則有可能實(shí)現(xiàn)在同一時間較強(qiáng)效果地除去各期端粒酶活性。即便如此，RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因靶向治療完全抑制端粒酶活性的實(shí)際臨床應(yīng)用仍然有很多目前尚未解決的難題。雖然目前有多種siRNA的體內(nèi)遞送方法，但它們應(yīng)用于人體臨床治療的安全性仍然是一個重大的問題。

[1] Masaharu A,Osamu Y,Naotoshi K,et a1.Telonlerase overelpression in K562 leukemia cells protects against apoptosis by serum deprivation and double-slranded DNA break inducing agents,but not against DNA synthesis inhibitors〔J〕.Cancer Lett,2002,178(2):187-197.

[2] Massaki S,Fumihiko K,Hisashi H,et al.Detection of telomerase activity,telomerase RNA component,and telomerase reverse transcriptase in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Science,2004,29(1):31-38.

[3] Tu Z,Zhang A,Wu R,et al.Genomic amplification of the human telomerase RNA gene for differential diagnosis of cervical disorders〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2009,191(1):10-16.

[4] Jin Y,Jia-Ping L,Dan H,et al.Clinical Significance of Human Telomerase RNA Gene (hTERC) Amplification in Cervical Squamous Cell Lesions Detected by Fluorescence in Situ Hybridization〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2011,12(5):1167-1171.

[5] 李 凌，江 維，李隆玉,等.熒光原位雜交技術(shù)檢測hTERC基因預(yù)測宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變1級自然轉(zhuǎn)歸的前瞻性研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2013,40(1)：25-28.

[6] Jose Emesto B,Dayson Friaca M.RNA interference against human cancers:a perspective〔J〕.Applied Cancer Res,2009,29(4):512-514.

[7] Zhongji M,Song Q,Xiaoyong Z,et al.Inhibition of woodchuck hepatitis virus gene expression in primary hepatocytes by siRNA enhances the cellular gene expression〔J〕.RNA,2009,384(1):88-96.