元建華 彭大為 李建旺 王美清

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡的紊亂密切相關。凋亡受抑制將導致細胞存活時間延長，有利于轉(zhuǎn)化突變的細胞生長積累，最終導致腫瘤的產(chǎn)生。細胞凋亡受多條通路和多種因子的調(diào)控。Livin 蛋白是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)成員之一，在人體的大多數(shù)正常組織中不表達或低表達，而在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達，并使腫瘤細胞對缺血、缺氧、化學治療及放射治療等產(chǎn)生耐受[1-2]。第二個線粒體來源的半胱氨酸酶的激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI，Smac/DIABLO)是1種重要的促凋亡因子，可以與IAPs成員結(jié)合，解除IAPs對含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspar-tate specific proteinase，Caspase)的抑制從而促進細胞凋亡[3]，因此Smac/DIABLO蛋白在腫瘤細胞凋亡中有著極其重要的作用。本研究采用免疫組化方法，檢測 100例結(jié)直腸癌患者中Livin蛋白、Smac/DIABLO蛋白的表達情況，以了解它們在結(jié)直腸癌中的表達情況及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2006年1月至2009年12月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的100 例初治結(jié)直腸癌患者的術后組織標本，所有患者均行根治性手術，術后定期隨訪?；颊呔哂型暾S訪資料，轉(zhuǎn)移復發(fā)情況明確。末次隨訪時間為 2013 年 6 月。其中男性54例，女性46例，男女比例為1.17∶1；年齡23～74歲，中位年齡 54 歲；腫瘤直徑<5 cm 49例，≥5 cm 51例。TNM分期采用AJCC第七版分期：Ⅰ+Ⅱ期 48例，Ⅲ期 52例。腫瘤浸潤深度：T1+T2期12例，T3期88例。組織學分類：高分化25例，中分化64例，低分化11例。所有病例術前未接受過任何抗癌治療。30 例正常對照標本取自經(jīng)病理檢查證實無腫瘤殘留的結(jié)直腸癌手術切除標本的切緣。

1.2 免疫組化SP法

取上述 130 例石蠟包埋標本，常規(guī)制備 4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及微波抗原修復后，滴加一抗及二抗，DAB染色，蘇木精復染。一抗為兔抗人Livin多克隆抗體(稀釋濃度為1∶100)、兔抗人Smac/DIABLO多克隆抗體(稀釋濃度為1∶200)，均購自美國ProSci生物技術公司。采用PBS代替一抗作為陰性對照；采用美國ProSci生物技術公司提供的陽性病理切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷標準

采用光學顯微鏡觀察切片中 10 個具有代表性視野中陽性細胞的比例，參考文獻[4]并結(jié)合實際情況制定陽性標準。無陽性細胞為 0 分，陽性細胞率1%～25%為 1 分，26%～50%為 2 分，51%～ 75%為 3 分，≥76%為 4 分；染色陰性為 0 分，弱染色為 1 分，中等強度染色為 2 分，強染色為 3 分。 將兩者分數(shù)相加為最終結(jié)果。將其分為 4個等級：0～1分為陰性(-)，2～ 3 分為弱陽性(+)，4～ 5 分為中等陽性(++)，6～ 7 分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。不同組間蛋白表達差異采用χ2檢驗，采用Spearman法分析 Livin 蛋白及Smac/DIABLO 蛋白表達的相關性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin 蛋白與 Smac/DIABLO 蛋白在結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中表達情況

結(jié)直腸癌組織中Livin 蛋白陽性表達率為64.0%(64/100)，而癌旁正常組織僅為16.7%(5/30)，結(jié)直癌組織明顯高于癌旁正常組織(χ2=11.208，P<0.001)。Smac/DIABLO 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率為60.0%(60/100)，癌旁正常組織其陽性表達率為80.0%(24/30)，兩者比較，χ2= 4.832，P<0.05。

2.2 Livin 及 Smac/DIABLO蛋白表達與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征的關系

Livin 蛋白陽性表達率與結(jié)直腸癌臨床分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小及組織分化程度無關(P>0.05)。Smac/DIABLO蛋白陽性表達率與結(jié)直腸癌臨床分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小及組織分化程度無關(P>0.05)。見表 1。

表1 結(jié)直腸癌組織中Livin及Smac/DIABLO蛋白表達與其臨床病理特征的關系/例

2.3 Livin 與 Smac/DIABLO 蛋白表達的相關性分析

36例Livin蛋白表達陰性的標本中有22例Smac/DIABLO蛋白表達陽性(61.1%)，60 例Smac/DIABLO蛋白表達陽性的標本中19例Livin蛋白表達陰性(31.7%)，經(jīng)Spearman相關性分析，結(jié)直腸癌組織中Livin蛋白與Smac/DIABLO蛋白表達呈顯著負相關(γ=-0.348，P<0.05)。

3 討論

腫瘤的無限制的增殖及凋亡紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，凋亡抑制蛋白的增多或凋亡促進蛋白的減少，均可導致腫瘤細胞凋亡減少而影響腫瘤的發(fā)展。Livin蛋白是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)最新的成員之一，是2000年由Kasof等[5-7]4個獨立的研究小組分別應用不同的方法從不同的組織中獲得的，分別命名為Livin、黑色素瘤凋亡蛋白抑制因子(melanoma inhibitor of apoptosis protein，ML-IAP)、腎IAP(kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP)，后統(tǒng)稱為Livin蛋白。Livin蛋白主要通過N端BIR結(jié)構(gòu)區(qū)與Caspases結(jié)合啟動以阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑，從而抑制凋亡蛋白酶的活性。Livin 蛋白可與激活形式的Caspases-3和Caspases-7結(jié)合，并抑制其活性，此外還可與未加工的或斷裂形式的Caspases-9結(jié)合，抑制由Apaf-1、細胞色素C及dATP誘導的Caspases-9激活作用。Livin蛋白在人體的大多數(shù)正常組織中不表達或低表達，而在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達。本研究顯示 Livin蛋白在結(jié)直腸癌中陽性表達率為64.0%(64/100)，而在癌旁正常組織中僅為16.7%(5/30)，差異具有統(tǒng)計學意義，提示 Livin蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過程中的重要作用。Livin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達與患者的年齡、性別及腫瘤的大小無關，但與臨床分期、腫瘤浸潤深度、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。Livin蛋白在Ⅰ-Ⅱ期陽性表達率為52.1%(25/48)，在Ⅲ期陽性表達率為75.0%(39/52)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.022)；腫瘤浸潤深度T1+T2陽性率為33.3%(4/12)，T3+T4陽性率為68.2%(60/88)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.012)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達率為75.0%(39/52)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達率為52.1%(25/48)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.022)，表明 Livin蛋白的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度以及臨床分期相關。Livin蛋白檢測可以用來判斷結(jié)直腸癌患者的預后，高表達提示預后較差，高表達是細胞凋亡的表現(xiàn)，低表達或不表達提示預后較好。

Smac/DIABLO蛋白是2000 年7月首次報道的1種促調(diào)亡蛋白，主要定位于線粒體[8]，通過與凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3競爭性的結(jié)合IAPs[9]如Survivin，解除IAPs對Caspase 3的抑制作用，從而促進細胞凋亡，Smac/DIABLO蛋白還可以激活機體對腫瘤細胞的免疫反應促進腫瘤細胞死亡[10]。有文獻報道，Smac/DIABLO蛋白在癌組織中的表達與結(jié)直腸癌的腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和病理分化程度有關，Smac/DIABLO蛋白表達陰性的結(jié)直腸癌患者較表達陽性的患者預后更差[11-13]。本研究顯示Smac/DIABLO蛋白在結(jié)直腸癌中陽性表達率為60.0%(60/100)低于癌旁正常組織的80.0%(24/30)，差異具有統(tǒng)計學意義。Smac/DIABLO蛋白在結(jié)直腸腸癌組織中的陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及組織分化程度無關，但與臨床分期、腫瘤浸潤深度、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。Smac/DIABLO蛋白在Ⅰ-Ⅱ期陽性表達率為75.0%(36/48)，在III期陽性表達率為46.2%(24/52)，兩者差異有統(tǒng)計學意義，P<0.004；腫瘤浸潤深度T1+T2陽性率為25.0%(3/12)，T3+T4陽性率為64.8%(57/88)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.008)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達率為46.2%(24/52)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達率為75.0%(36/48)，兩者差異有統(tǒng)計學意義，P<0.022；說明大腸癌中 Smac/DIABLO 蛋白表達缺失與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關。本研究提示Smac/DIABLO蛋白低表達與結(jié)直腸癌進展密切相關，而低表達是細胞凋亡抑制的表現(xiàn)，但抑制 Smac/DIABLO蛋白釋放的原因目前還不清楚，值得進一步探討。

Livin蛋白的抗凋亡作用還受到線粒體釋放的Caspase活化蛋白(Smac/DIABLO)的調(diào)節(jié)，Livin蛋白能通過BIR結(jié)構(gòu)與Smac/DIABLO蛋白結(jié)合，促使Smac/DIABLO蛋白經(jīng)泛素2蛋白酶途徑降解，降低Smac/DIABLO 蛋白表達水平，抑制細胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌中Livin蛋白 與 Smac/DIABLO蛋白表達呈負相關，提示兩者的基因表達在結(jié)直腸癌中存在負反饋調(diào)節(jié)或存在相互拮抗的關系，Smac/DIABLO蛋白表達減少直接或間接引起 Livin 蛋白的表達升高，或者是由于Livin 蛋白或其他 IAP 家族成員的過表達抑制了Smac/DIABLO蛋白從線粒體的釋放，從而減少了細胞的凋亡。 Smac/DIABLO蛋白的低表達及 Livin 蛋白的高表達在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，兩者可能在結(jié)直腸癌細胞凋亡信號傳導網(wǎng)絡中起到重要作用，但其具體作用機制尚未闡明，聯(lián)合檢測Livin 蛋白和 Smac/DIABLO蛋白在結(jié)直腸癌中的表達情況，有助于評價結(jié)直腸癌的預后情況，并為結(jié)直腸癌的抗腫瘤治療提供了新的途徑和方法。

[1] Bencomo E，Perez R，Arteaga MF，et al.Apoptosis of cultured granulosa-lutein cells is reduced by insulin-like growth factor I and may correlate with embryo fragmentation and pregnancy rate〔J〕.Fertil Steril，2006，85(2)：474-480.

[2] Vaira V，Lee CW，Goel HL，et al.Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007，26(19)：2678-2684.

[3] Qin S，Yang C，Li S，et al.Smac：Its role in apoptosis induction and use in lung cancer diagnosis and treatment〔J〕.Cancer Lett，2012，318(1)：9-13.

[4] 黎軍和，何文靜，何友兼，等.Survivin和Livin在Dukes'B期結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.癌癥，2007，26(5)：547-551.

[5] Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.J Biol Chem，2001，276(5)：3238-3246.

[6] Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000，279(3)：820-831.

[7] Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000，10(21)：1359-1366.

[8] 李維山，左曙光，鄢文海，等.細胞色素C和Survivin在結(jié)腸腺癌中的表達及臨床意義〔J〕.實用醫(yī)學雜志，2012，28(2)：226-228.

[9] De Oliveira Lima F，De Oliveira Costa H，Barrezueta LF，et al.Immunoexpression of inhibitors of apoptosis proteins and their antagonist SMAC/DIABLO in colorectal carcinoma：correlation with apoptotic index，cellular proliferation and prognosis〔J〕.Oncol Rep，2009，22(2)：295-303.

[10] Emeagi PU，Van Lint S，Goyvaerts C，et al.Proinflammatory characteristics of SMAC/DIABLO-induced cell death in antitumor therapy〔J〕.Cancer Res，2012，72(6)：1342-1352.

[11] Endo K，Kohnoe S，atanabe A，et al.Clinical significance of Smac/DIABLO expression in colorectal cancer〔J〕.Oncol Rep，2009，21(2)：351-355.

[12] 王保平，朱耀明，朱晨宇，等.結(jié)直腸癌組織中smac的表達及意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2008，48(3)：45-46.

[13] 孫紅芹，趙長林，胡芳娟，等.直腸癌組織Smac與Survivin表達及其臨床意義的探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2011，18(12)：956-960.

[14] Ma L，Huang Y，Song Z，et al.Livin promotes Smac/DIABLO degradation by ubiquitin-proteasome pathway[J].Cell Death Differ，2006，13(12)：2079-2088.