鄭 航 崔彥芝 陳逢生

索拉非尼最初是在對(duì)c-RAF激酶的抑制劑先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)-活性評(píng)價(jià)的生化分析中被發(fā)現(xiàn)的，其對(duì)c-RAF、野生型和突變型b-RAF有強(qiáng)效的抑制作用，直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能抑制人VEGFR-2和小鼠VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、FLT3和c-KIT的酪氨酸激酶活性，阻斷腫瘤新生血管的形成和切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，有雙重抗腫瘤作用[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是發(fā)病率和病死率都很高的惡性腫瘤，目前化療使晚期NSCLC的病死風(fēng)險(xiǎn)下降尚不足30%；對(duì)于放化療失敗的NSCLC患者，尚缺乏有效手段控制其病情進(jìn)展。因此，有必要尋找和開發(fā)新的藥物，近年來興起的分子靶向治療藥物日益引起重視。本研究通過觀察索拉非尼聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制效果及對(duì)裸鼠免疫功能的影響，為索拉非尼治療肺癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、動(dòng)物與細(xì)胞株

索拉非尼片劑為拜耳制藥公司產(chǎn)品。順鉑注射液為連云港豪森制藥生產(chǎn)。

4～5 周齡的 BALB/c(nu/nu)裸小鼠 50 只，SPF級(jí)，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。A549肺癌細(xì)胞株來源于本中心。

1.2 人肺癌 A549裸鼠移植瘤模型的建立及治療實(shí)驗(yàn)分組

人肺癌A549細(xì)胞懸液(含活細(xì)胞5×106/ml)接種于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠注射0.2 ml。將成瘤小鼠(瘤重達(dá)120～140 mg)隨機(jī)分成空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、索拉非尼組、順鉑組和聯(lián)合用藥組共5組，每組10只。索拉非尼組給予索拉非尼30 mg/kg，胃管灌入0.1 ml，每天1次，共12 d；腹腔注射生理鹽水0.2 ml，每4 d 1次，共3次；順鉑組給予順鉑5 mg/kg，腹腔注射0.2 ml，每4 d 1次，共3次，生理鹽水0.1 ml胃管灌入，每天1次，共12 d。聯(lián)合用藥組給予索拉非尼30 mg/kg，順鉑5 mg/kg，2種藥物于同一天開始給藥，早上給予索拉非尼，下午給予順鉑，時(shí)間間隔3～5 h。而溶劑對(duì)照組給予稀釋至與索拉非尼組相同濃度的溶劑0.1 ml，腹腔注射0.2 ml生理鹽水，時(shí)間同上述?？瞻讓?duì)照組按上述給藥方式及時(shí)間給予生理鹽水腹腔注射或胃管灌入。

1.3 裸鼠體重及瘤重的測(cè)定

給藥第1天開始測(cè)體重和瘤重，每周測(cè)2次。應(yīng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(a)及短徑(b)；瘤體積根據(jù)以下公式計(jì)算：瘤重=(a×b2)/2，繪制皮下腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.4 療效及毒性評(píng)價(jià)

療效評(píng)價(jià)以治療后腫瘤體積增長(zhǎng)至治療前2倍所需的時(shí)間，用T2表示。療效以完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)和腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間(tumor growth delay，TGD)來評(píng)價(jià)：肉眼皮下腫瘤完全消失至少超過5 d為CR；腫瘤體積縮小在50%～100%間，并至少持續(xù)5 d為PR；TGD指處理組T2與空白對(duì)照組T2的差值。毒性評(píng)價(jià)：以超過20%裸鼠死亡和(或)體重(去除瘤重)減輕超過20%為毒性標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼、順鉑單藥和聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌 A549移植瘤的治療效應(yīng)

聯(lián)合用藥組腫瘤生長(zhǎng)較其余4組均慢，表明聯(lián)合用藥組抑制腫瘤生長(zhǎng)效果優(yōu)于索拉非尼及順鉑單藥組。治療后第25天空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組腫瘤瘤體積比較無顯著性差異(P=0.072)，聯(lián)合用藥組腫瘤瘤體積小于索拉非尼及順鉑單藥組(P<0.01)，見圖1。

各治療組與對(duì)照組相比，T2明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；聯(lián)合用藥組T2(29.05 d)長(zhǎng)于索拉非尼(19.31 d)和順鉑組(21.22 d)。聯(lián)合用藥組TGD較索拉非尼(8.53 d)及順鉑單藥組(9.72 d)長(zhǎng)，達(dá)16.73 d，見表1。

2.2 索拉非尼、順鉑單藥和聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌 A549移植瘤的安全性和毒性

各治療組耐受性良好，每組均病死率均示超過20%，體重減少亦未超過20%。溶劑對(duì)照組、順鉑組、索拉非尼組及聯(lián)合用藥組各死亡1只。各組均無CR，其中索拉非尼單藥組及聯(lián)合用藥組各有1只PR，見表2。

圖1 索拉非尼、順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞移植瘤模型瘤體積的影響

組別 T2/dTGD/d空白對(duì)照組11.75±2.83 0溶劑對(duì)照組10.91±3.02-0.84Sorafenib組20.28±2.03? 8.53DDP組21.47±3.87? 9.72Sorafenib+DDP組28.48±4.35?#△ 16.73

注：*為與對(duì)照組比較P<0.05；△為與Sorafenib組比較P<0.05；#為與DDP組比較P<0.05；T2為腫瘤增長(zhǎng)至治療前瘤體積2倍所需的時(shí)間；TGD為腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間。

表2 索拉非尼、順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌 A549細(xì)胞移植瘤裸鼠的療效和毒性

注：* 為去除瘤重的體重。

3 討論

對(duì)于晚期難治性肺癌病例，徹底根治的機(jī)會(huì)很小，而延長(zhǎng)生存期、提高生活質(zhì)量則成為更為重要的目標(biāo)。索拉非尼聯(lián)合化療藥物方案可以是很多晚期實(shí)體瘤有價(jià)值的治療方案選擇之一。本實(shí)驗(yàn)通過索拉非尼聯(lián)合順鉑在人肺癌移植瘤模型中的研究，觀察兩藥聯(lián)合的安全性及抗腫瘤活性，為臨床的應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

研究[1-2]顯示，索拉非尼每日1次口服對(duì)人腫瘤的動(dòng)物移植模型了廣泛的抗腫瘤活性，如小鼠非小細(xì)胞肺癌模型NCI-H460、NCI-H23和A549，結(jié)腸癌模型HT-29、DLD-1、HCT-116和Colo-205，乳腺癌模型MDA-MB-231、胰腺癌模型Mia-Paca-2等，腫瘤的生長(zhǎng)抑制率為30%～94%。與紫杉醇、伊立替康、吉西他濱和順鉑等聯(lián)合應(yīng)用后抗腫瘤作用增強(qiáng)，而毒副作用不增強(qiáng)[3-4]。 Carter等[5]在NCI-H460模型中，應(yīng)用長(zhǎng)春瑞濱(6.7 mg/kg)和索拉非尼(40 mg/kg)治療后，單藥TGD分別為2.4 d和7.8 d，聯(lián)合用藥TGD達(dá)10.0 d，且毒副作用不增強(qiáng)；而在NCI-H23模型中，高劑量索拉非尼聯(lián)合順鉑耐受性良好，療效與順鉑單藥相仿，但低劑量?jī)伤幝?lián)合產(chǎn)生相加的作用，療效優(yōu)于單藥或至少和單藥相似[5]。達(dá)卡巴嗪(DTIC)聯(lián)合或不聯(lián)合索拉非尼作為一線方案治療晚期黑色素瘤患的Ⅱ期隨機(jī)研究結(jié)果顯示[6]，索拉非尼+DTIC組較安慰劑+DTIC 組的中位TTP顯著延長(zhǎng)(21.1 周對(duì)11.7 周，RR 為0.619，P=0.039)；兩組最佳應(yīng)答率(ORR：CR+PR)、疾病控制率分別為24% vs 12%和71% vs 56%；兩組6個(gè)月和9個(gè)月PFS率分別為41% vs 20%和22% vs 12%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)瘤重增長(zhǎng)曲線，索拉非尼和順鉑無論單藥還是聯(lián)合，均顯示出抗腫瘤活性，而聯(lián)合用藥腫瘤生長(zhǎng)比單藥更慢。索拉非尼單藥組和順鉑單藥組的TGD分別為8.53 d和9.72 d，聯(lián)合用藥組出現(xiàn)了更長(zhǎng)的TGD，達(dá)16.73 d。索拉非尼聯(lián)合順鉑在裸鼠A549細(xì)胞移植瘤模型中顯示出了增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。與上述結(jié)果一致。

臨床試驗(yàn)顯示[7]，索拉非尼聯(lián)合化療藥物在多種進(jìn)展期實(shí)體瘤包括RCC、黑色素瘤、HCC和結(jié)腸癌中，取得優(yōu)于單藥甚至相加的作用，聯(lián)合治療的疾病控制率達(dá)79%，而且具有較好的安全性和耐受性，聯(lián)合應(yīng)用的安全性和耐受性與臨床前研究的結(jié)果相一致[3-4]。其主要不良反應(yīng)是手足綜合征、皮疹、腹瀉和疲乏，這些不良反應(yīng)多為暫時(shí)性的輕度、中度反應(yīng)，經(jīng)對(duì)癥處理可恢復(fù)正常。本研究中，溶劑對(duì)照組、順鉑組及聯(lián)合用藥組各有1只裸鼠死亡，索拉非尼組有1只死亡，其中溶劑對(duì)照組、索拉非尼組及聯(lián)合組裸鼠死亡為灌胃操作不當(dāng)引起。順鉑組死亡裸鼠解剖后未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)腫大，考慮藥物毒性所致。各組裸鼠死亡率及體重減輕均未超過20%，提示聯(lián)合用藥組亦未出現(xiàn)比單藥更強(qiáng)的毒性，該濃度索拉非尼和順鉑兩藥聯(lián)用是安全、能耐受的。

索拉非尼在體外試驗(yàn)中可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的Bcl-2家族成員Mcl-1下調(diào)[8]，而抗凋亡分子(如Bcl-2)的過表達(dá)可能是化療藥物的耐藥機(jī)制之一[9]。最近的證據(jù)顯示，Bcl-2 和C-Raf可協(xié)同抑制凋亡[9]，Raf可以上調(diào)多藥耐藥基因(mdr-1)的表達(dá)[10]，因此，或許可以通過Raf抑制劑如索拉非尼來減低化療藥物的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)單藥化療抵抗的腫瘤與索拉非尼聯(lián)用時(shí)顯示出了增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，提示了索拉非尼可能增強(qiáng)這些化療藥的敏感性。比如，索拉非尼聯(lián)合奧沙利鉑治療奧沙利鉑無效的結(jié)腸癌患者仍可使疾病得到穩(wěn)定；對(duì)紫杉類、鉑類及蒽環(huán)類抵抗的卵巢癌患者接受索拉非尼聯(lián)合吉西它濱治療仍可出現(xiàn)PR[11]。吉西它濱治療無效的鼻咽癌患者聯(lián)合索拉非尼后SD仍可超過1年[11]。這些結(jié)果與臨床前研究喲一致性，其機(jī)制值得我們深入研究。

總之，索拉非尼及順鉑聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌 A549裸鼠移植瘤模型顯示出了增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。兩藥在該劑量水平聯(lián)合具有較好的安全性和耐受性。隨著對(duì)生物化療這一模式研究的深入，無論是臨床前還是臨床試驗(yàn)，越來越多的聯(lián)合方案及實(shí)體腫瘤被納入研究中。索拉非尼聯(lián)合化療藥物這種生物化療方案逐漸成為研究熱點(diǎn)，但其內(nèi)在聯(lián)合機(jī)制仍未明確，有待進(jìn)一步探討。

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