雷宏偉 龍 成 姜永梅 佟恩娟 滕 云 李國權

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin，PG)的限速酶，其亞型COX-2在多數惡性腫瘤中呈過度表達并與腫瘤預后密切相關[1-2]。已有研究表明COX-2的過度表達與放療抵抗正相關。選擇性COX-2抑制劑不僅具有抗腫瘤活性[3]，還有放療增敏效應[4]，但其放射增敏機制還未明確。本實驗采用人肺腺癌A549細胞株，觀察選擇性COX-2抑制劑celecoxib對放射引起凋亡和DNA損傷修復的影響，進一步探討celecoxib的放療增敏機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺腺癌A549細胞系購自本院中心實驗室。Celecoxib購自大連美侖生物技術公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學研究所。引物序列、DNA Maeker及RT-PCR試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司。醫(yī)用直線加速器(美國Varian公司)；FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD公司)；ΜVP(CA91786)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GENE公司)；核酸蛋白定量儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將A549細胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、分離、傳代。將細胞分為對照組(給相同體積的DMSO)、藥物組(celecoxib)、照射組(6MV X射線6 Gy)、聯(lián)合組〔celecoxib+6 GyX射線(藥物作用24 h后)〕，離心收集對數生長期A549細胞，分別種植于96孔板和6孔板中，細胞密度分別為6000細胞/孔和2.5×105細胞/孔。照射方法：醫(yī)用直線加速器，劑量率200 cGy /min，源皮距100 cm。

1.2.2 CCK-8法檢測celecoxib的增殖抑制作用、IC50值及確定放療增敏劑量 取對數生長期的A549細胞按每孔6×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板(100 μl/每孔)。加入不同濃度的celecoxib培養(yǎng)液100 μl，設置5個濃度梯度(10～160 μmol/L)，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀在550 nm處測定各孔吸光度值(A)，實驗重復3次。細胞對照組是A549細胞及培養(yǎng)液，空白對照組為等體積包含DMSO的培養(yǎng)液。公式為：①腫瘤細胞存活率(%)=〔(加藥組A值-空白對照組A值)/(細胞對照組A值-空白對照組A值)〕×100%；②腫瘤細胞抑制率(%)=1-腫瘤細胞存活率(%)。

1.2.3 半定量RT-PCR 取對數生長期的A549細胞根據實驗分組進行處理，celecoxib作用48 h后收獲細胞，按說明書完成RNA提取純化、cDNA的合成及PCR擴增。DNA-PKcs上游引物5'-ATCTCTTAAAGCGGGCCTTCG-3'，下游引物5'-AGGCATCAACTCA GGGACTGG-3'，退火溫度58℃，擴增產物239bp。Ku80上游引物5'-TATGCTCCCACCGAGGCACAGTTGA-3'，下游引物5'-ACTGCCTTCAGCCAGACTGGAGACG-3'，退火溫度56℃，擴增產物478 bp[5]；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物5'-ATGGTGGTGAAGACG CCAGT-3'，退火溫度56℃，擴增產物416 bp。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外燈下觀察拍照。應用quantity one電泳圖片分析軟件分析，目的基因和GAPDH的灰度比值表示mRNA相對表達量。

1.2.4 Western blot實驗 取對數生長期的A549細胞根據實驗分組進行處理，celecoxib作用48 h后收獲細胞，4℃PBS 液洗3遍，細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，用6%、12%的分離膠做SDS-PAGE，轉移至NC膜上，用5%脫脂奶TBST室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次(每次10 min)，室溫下辣根過氧化物酶二抗孵育1.5 h，TBST洗滌3次(每次10 min)，ECL曝光試劑盒曝光顯影。掃描Western Blot蛋白條帶，應用ImageMasterTM 2D Platinum軟件分析灰度。目的蛋白與GAPDH的灰度比值表示蛋白相對表達量。

1.2.5 流式細胞儀檢測凋亡率 取對數生長期的A549細胞分別根據實驗分組進行相應處理，celecoxib作用48 h后收獲細胞，胰酶消化，加1640培養(yǎng)液，取105個細胞，固定染色，應用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復3次，采用t檢驗和方差分析分析組間和組內數據，數據分析應用SPSS 17.0軟件。

2 結果

2.1 Celecoxib對A549細胞增殖抑制作用及IC50值

不同濃度的celecoxib作用于A549細胞，對細胞增殖均有抑制作用，隨celecoxib濃度及作用時間的逐漸增加，細胞抑制率逐漸增高(P<0.01)，見表1。Celecoxib作用A549細胞48 h的IC01值為18.44 μmol/L，IC50值為58.74 μmol/L。取IC01值，即18.44 μmol/L作為后續(xù)實驗的放療增敏劑量。

表1 Celecoxib對A549細胞增殖抑制作用

2.2 Celecoxib聯(lián)合照射對A549細胞DNA-PKcs和Ku80mRNA表達的影響

DNA-PKcs mRNA表達：對照組(1.411±0.044)，藥物組(1.222±0.165)，照射組(1.632±0.055)，聯(lián)合組(0.588±0.05)。與對照組相比，照射組表達量升高(P<0.05)，藥物組表達量較對照組下降(P<0.05)，聯(lián)合組表達量較其余3組均明顯下降(P均﹤0.01)。Ku80mRNA表達：對照組(0.611±0.046)，藥物組(0.553±0.012)，照射組(0.662±0.018)，聯(lián)合組(0.301±0.016)。與對照組相比，照射組表達量升高(P<0.05)，藥物組表達量較對照組下降(P<0.05)，聯(lián)合組表達量較其余3組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果提示放射可誘導DNA-PKcs和Ku80在mRNA水平表達增強，而celecoxib可顯著抑制放射誘導的DNA-PKcs和Ku80RNA表達。

2.3 Celecoxib聯(lián)合照射對A549細胞DNA-PKcs和Ku80蛋白的影響

DNA-PKcs蛋白表達：對照組(1.570±0.436)，藥物組(1.492±0.045)，照射組(1.858±0.021)，聯(lián)合組(1.195±0.025)。與對照組相比，照射組表達量升高(P<0.01)，藥物組表達量較對照組下降(P<0.05)，聯(lián)合組表達量較其余3組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。Ku80蛋白表達：對照組(1.504±0.020)，藥物組(1.454±0.018)，照射組(1.996±0.016)，聯(lián)合組(1.240±0.0314)。與對照組相比，照射組表達量升高(P<0.01)，藥物組表達量較對照組下降(P<0.05)，聯(lián)合組表達量較其余3組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。結果提示放射可誘導DNA-PKcs和Ku80在蛋白表達水平增高，而celecoxib可抑制放射誘導的DNA-PKcs、Ku80蛋白和RNA表達。

1、2、3、4分別代表對照組、藥物組、照射組、聯(lián)合組

2.4 Celecoxib聯(lián)合照射對A549細胞凋亡的影響

對照組、藥物組、照射組、聯(lián)合組凋亡率分別為(2.11±0.05)%、(4.72±0.09)%、(9.80±0.05)%、(11.95±0.04)%，照射組、藥物組凋亡率高于對照組(P<0.01)，聯(lián)合組凋亡率明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

研究證實應用COX-2抑制劑能有效減少患惡性腫瘤的風險并抑制腫瘤形成的進程[6]。Celecoxib是選擇性COX-2的抑制劑，已在多項實驗中表現(xiàn)腫瘤細胞增殖抑制作用。本實驗研究顯示celecoxib對A549細胞具有增殖抑制作用，且隨藥物劑量、作用時間的增加而升高。

DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks，DSBs)是電離輻射引起細胞死亡的主要原因之一，在哺乳類細胞中，非同源末端結合重組(DNA nonhomologous end-joining，NHEJ)是DSBs損傷修復中最重要的一種方式，DNA-PKcs、Ku70、Ku80等因子參與NHEJ修復。DNA-PK由DNA-PKcs和Ku組成，在輻射誘導的NHEJ修復中起到核心作用，其功能的喪失可導致細胞DSBs損傷修復能力的降低，使細胞對電離輻射的敏感性增高。已有研究提示放射線可引起膠質母細胞DNA-PKcs蛋白的升高[7]，而DNA-PK的高表達是放療抵抗的可能機制之一，因此DNA-PK是放射增敏的潛在新靶點。有研究應用siRNA的方法敲除Ku80的基因，發(fā)現(xiàn)Ku80表達陰性的宮頸癌細胞對電離輻射的敏感性增高[8]。Ku80低表達的非小細胞肺癌患者預后及治療效果明顯好于Ku80高表達者[9]。Ku70低表達的腫瘤細胞對放射線更敏感，因此可以通過Ku70蛋白的表達水平來預測放療療效和局部控制率[10]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)照射組DNA-PKcs、Ku80的mRNA、蛋白表達均高于對照組，而聯(lián)合組DNA-PKcs、Ku80的mRNA、蛋白表達均比其它各組降低，提示celecoxib聯(lián)合照射可降低DNA-PKcs、Ku80的表達，故COX-2可能是影響DNA損傷修復因子的上游調節(jié)因子之一，celecoxib可通過抑制放射誘導的DNA損傷修復蛋白表達從而起到放療增敏作用。

放射線導致的不能被修復的DNA損傷激活凋亡相關基因，誘導細胞凋亡。DNA-PK是感受DNA損傷的分子探測器，它的高表達可抑制細胞凋亡[11]。利用siRNA方法抑制DNA-PK的轉錄，或者利用抑制劑直接抑制其蛋白表達，均可以減少DNA損傷修復和誘導凋亡[12-13]。本實驗結果顯示，celecoxib聯(lián)合照射抑制DNA-PKcs表達的同時，促進了細胞的凋亡。進一步證明，DNA-PKcs對細胞凋亡的作用。

綜上所述，選擇性COX-2抑制劑celecoxib對肺腺癌A549細胞具有放射增敏的作用，其作用可能通過抑制DNA-PKcs及ku80的表達，減少DNA損傷修復及促進放射誘導的凋亡的途徑實現(xiàn)。但深入的分子機制還有待進一步研究。

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