劉 洋 胡翠寧

(錦州市中心醫(yī)院內分泌科，遼寧 錦州 121001)

心肌纖維化是糖尿病心肌病(DCM)的一個重要特征，是導致心肌收縮和舒張功能障礙的重要因素〔1〕。研究表明，轉化生長因子-β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)參與了DCM心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程〔1〕。厄貝沙坦作為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑可阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))，在DCM中發(fā)揮重要的心肌保護作用。本實驗通過建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，并用厄貝沙坦進行干預，探討厄貝沙坦對DCM大鼠TGF-β1、CTGF的影響及其抑制心肌纖維化,改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；厄貝沙坦(商品名安博維，杭州賽諾菲安萬特制藥有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(上海康為醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)；One Touche 血糖儀(美國強生公司)；CIAS-1000細胞圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本)。

1.2動物分組、模型制備及給藥方法 健康雄性SD大鼠30只，體重(BW)200～250 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取30只給予高糖高脂飼料(飼料組成：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)，4 w后禁食12 h，給予1% STZ 30 mg/kg尾靜脈一次性注射，臨用前用0.1 mmol/L pH值為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制，72 h后尾靜脈采血測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功〔2〕。其余10只作為正常對照組，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，4 w后注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。將20只造模成功大鼠隨機分為糖尿病模型組、厄貝沙坦組，每組10只。厄貝沙坦組灌胃給予厄貝沙坦50 mg·kg-1·d-1，正常對照組、糖尿病組每日灌胃給予等體積的生理鹽水，連續(xù)用藥12 w結束實驗。每周用血糖儀測一次尾靜脈血血糖，血糖<16.7 mmol/L者及時剔除實驗。

1.3血流動力學指標檢測 12 w末，各組大鼠斷尾采血測血糖后稱體重(BW)，用20%的烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，于頸部偏右側開縱形切口，分離右側頸總動脈，經右頸總動脈插管至左心室，連接BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，測定左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力上升及下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.4心臟重量指數(HWI)和左心室重量指數(LVWI)測定 將大鼠迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱心臟重量(HW)，剖取心臟，將左右心房和右心室剪去，剩余部分即為左心室，稱左心室重量(LVW)。計算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)。從左心室取部分心尖部組織，置于10%中性甲醛中固定，用于光鏡觀察心肌組織形態(tài)學改變和免疫組化法檢測TGF-β1、CTGF的表達；剩余心尖部組織置于2.5%戊二醛中固定，用于電鏡觀察心肌組織超微結構變化。

1.5HE染色光鏡觀察心肌組織形態(tài)學改變 取置于10%中性甲醛中固定的部分心尖部組織，脫水透明浸蠟，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學改變。

1.6免疫組化法檢測TGF-β1、CTGF蛋白表達 采用SABC法，一抗為兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗體，按試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達，每張切片選取5個視野，應用CIAS-1000細胞圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定平均光密度值(OD值)，取其均值。

1.7電鏡觀察心肌組織超微結構變化 每組隨機選取2只大鼠心尖部組織，切成1 mm3大小組織塊，置于2.5%的戊二醛溶液中固定2 h，1%鋨酸固定1 h后，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片(50 nm)后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察各組大鼠心肌組織超微結構變化。

1.8統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般狀況比較 正常對照組：體重明顯增加，精神狀況良好，皮毛有光澤，反應靈敏。糖尿病組：精神萎靡，明顯消瘦，出現多飲、多尿，弓背蛇體，皮毛無光澤，活動減少，反應遲鈍。厄貝沙坦組：精神狀況較好，反應靈敏度較正常對照組稍差，但仍高于糖尿病組。實驗過程中糖尿病組大鼠死亡2只，厄貝沙坦組死亡1只，死亡原因是血糖過高導致糖尿病酮癥酸中毒、感染。

2.2大鼠血流動力學結果比較 與正常對照組比較，糖尿病組大鼠LVEDP明顯升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.01)；與糖尿病組比較，厄貝沙坦組LVEDP明顯降低(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax升高(P<0.05和P<0.01)，見表1。

2.3大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比較 與正常對照組比較，糖尿病組和厄貝沙坦組血糖明顯升高(P<0.01)，糖尿病組和厄貝沙坦組血糖比較無明顯差別(P>0.05)；糖尿病組大鼠HWI、LVWI高于正常對照組(P<0.01)；厄貝沙坦組HWI、LVWI低于糖尿病組(P<0.05和P<0.01)，見表2。

表1 各組大鼠血流動力學結果比較

表2 各組大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比較

2.4HE染色光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊致密，細胞核呈圓形或橢圓形，大小均勻，細胞間質正常，肌纖維排列整齊，無斷裂；糖尿病組心肌細胞肥大、腫脹、壞死，邊界不清，間質及間質膠原較多，肌纖維部分斷裂，排列明顯紊亂；厄貝沙坦組心肌細胞變性壞死程度和間質纖維化程度范圍明顯減輕，見圖1。

圖1 大鼠心肌組織HE染色結果(×200)

2.5電鏡下觀察心肌組織超微結構變化 正常對照組大鼠心肌細胞核呈橢圓形，染色質均勻分布，肌絲結構清楚，Z帶和I帶整齊規(guī)則，未見肌絲溶解，線粒體結構正常清晰，細胞間質較少。糖尿病組心肌細胞核輕度腫脹，染色質分散分布，線粒體結構模糊，細胞器結構紊亂，肌絲結構不清，肌纖維間隙增寬，肌絲溶解，Z帶和I帶部分走行紊亂，間質膠原纖維增多，心肌纖維化明顯。厄貝沙坦組心肌病變明顯減輕，部分肌原纖維排列紊亂，線粒體水腫減輕，細胞間質減少。

2.6心肌組織TGF-β1、CTGF的蛋白表達結果比較 見表3，圖2,圖3。與正常對照組比較，糖尿病組心肌組織TGF-β1、CTGF的表達明顯升高(P<0.01)；與糖尿病組比較，厄貝沙坦組心肌組織TGF-β1、CTGF的表達明顯降低(P<0.01)。

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、CTGF的平均OD值比較

圖2 大鼠心肌組織TGF-β1表達(×400)

圖3 大鼠心肌組織CTGF表達(×400)

3 討 論

DCM以心肌細胞肥大、凋亡、心肌間質膠原沉積和纖維化為主要特征，是糖尿病患者晚期的主要死亡原因之一。STZ誘導糖尿病大鼠于成模后8 w左右就可以出現DCM的表現。本實驗采用高脂高熱量飲食誘導出胰島素抵抗，加尾靜脈注射小劑量STZ建立DCM動物模型成功。經厄貝沙坦干預后，心肌病變明顯減輕，與多數研究結果相一致〔3〕。

本實驗表明TGF-β1、CTGF與DCM的發(fā)生發(fā)展過程有密切關系，這一結論與郎宏濤等〔4〕的研究相似。TGF-β1是最重要的致心肌間質纖維化細胞因子之一。TGF-β1是多功能生長因子，一方面對許多組織器官的生長分化起著重要作用，另一方面通過發(fā)揮促進心肌細胞肥大，促進細胞外基質(ECM)如FN、Ⅱ型膠原等的合成和抑制ECM降解，使ECM在細胞周圍沉積，膠原增生等作用造成糖尿病的靶器官損傷，參與了DCM的發(fā)病過程，導致心功能不全，最終導致心力衰竭的發(fā)生。研究發(fā)現，糖尿病時高血糖〔5〕、AngⅡ〔6〕、糖尿病時晚期糖化終末產物(AGEs)〔7，8〕、一氧化氮〔9〕等多種因素均可引起心肌組織中TGF-β1升高，因此，抑制心肌組織中TGF-β1的高表達成為DCM治療的靶標。

Piet等〔10〕研究發(fā)現，在擁有人類腎素及血管緊張素原基因的轉基因鼠中，CTGF表達水平增高的同時伴有TGF-β1、Ⅰ型膠原基因和Ⅲ型膠原基因表達增高。大量文獻表明TGF-β1是CTGF的強誘導劑，在CTGF的啟動子-157至-145核苷酸序列存在一個新的應答元件，CTGF是TGF-β1發(fā)揮纖維化作用的下游效應介質。因此，TGF-β1的生物學作用部分由CTGF介導的。體外實驗發(fā)現TGF-β1可引起人心臟心肌細胞及成纖維細胞中CTGF mRNA表達增高，并伴隨細胞外基質的產生增加，CTGF的拮抗劑可抑制TGF-β1誘導的致纖維化作用。

DCM病后腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAS)系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，心肌局部AngⅡ可直接通過蛋白激酶C(PKC)途徑引起TGF-β1過度表達，并通過細胞表面的AT1受體介導CTGF表達增加，兩者均可促進心肌間質纖維化以及細胞外基質膠原沉積，導致心肌肥厚及纖維化，最終導致心室收縮及舒張功能受損〔11〕。厄貝沙坦為AT1受體拮抗劑，可阻止AngⅡ與AT1受體結合，阻斷內源性及外源性AngⅡ引起的心肌纖維化。在STZ誘導糖尿病大鼠模型中，心肌組織CTGF表達和AngⅡ含量呈明顯的正相關，厄貝沙坦干預后，CTGF表達和AngⅡ含量均降低〔12〕。研究表明，短期或長期應用AngⅡ可導致STZ大鼠心肌細胞凋亡，AT1受體拮抗劑氯沙坦則可減輕DCM大鼠心肌纖維化并改善心功能〔13，14〕。本實驗表明厄貝沙坦通過選擇性地與AT1受體結合降低了TGF-β1的表達，從而間接影響了CTGF的表達，并且在抑制心肌纖維化的同時，改善了糖尿病大鼠的心功能。

本實驗表明厄貝沙坦通過降低DCM心肌組織TGF-β1和CTGF的表達，發(fā)揮抑制心肌間質纖維化，改善心功能的作用，從而為DCM進展為心力衰竭提供了新的治療靶點，為厄貝沙坦治療DCM提供了有力的實驗依據。

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