周 雨 易德保 蔣傳命 王 樂 凌 暉

(邵陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南 邵陽 422000)

胃癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤〔1～3〕。干細胞標志物(CD44)及ATP-結(jié)合盒亞家族成員2(ABCG2)是常用的研究腫瘤干細胞耐藥性的分子標志物，在胃癌組織中的表達與胃癌發(fā)生及分化有明顯關(guān)系。本研究觀察40例老年胃癌患者的胃癌組織中CD44和ABCG2蛋白的表達情況，并就兩者的相關(guān)性進行分析，從而了解CD44和ABCG2與胃癌發(fā)生及發(fā)展的聯(lián)系，最終為老年胃癌的早期診斷、治療效果評價、判斷預后的腫瘤標記物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 老年胃腺癌組織40例來源于邵陽市中心醫(yī)院及邵陽醫(yī)專附屬醫(yī)院2008年1月至2009年12月的手術(shù)切除標本。其中男28例，女12例，年齡56～78〔平均(64±7.3)〕歲，術(shù)前均未接受化療、放療等治療。

1.2試劑來源及試驗方法 研究所用試劑包括兔抗CD44抗體、兔抗ABCG2抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、免疫組化(SP)試劑盒等，所有試劑均購自Abcam公司及博士德公司。經(jīng)脫蠟水化及抗原修復后將切片置于3％H2O2中淹沒浸泡30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min 3次，使用10％正常山羊血清，中和非特異性反應，濕盒內(nèi)放置20 min。滴加1∶1 000比例稀釋的CD44抗體及1∶200比例稀釋的ABCG2抗體于切片上，置濕盒內(nèi)，4℃冰箱過夜。取出，室溫下放置5 min，PBS洗3 min 3次，吸去水分，滴加二抗工作液，于濕盒內(nèi)37℃孵育25 min。溫度設(shè)置為37℃條件下，使用辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素工作液，于濕盒內(nèi)孵育20 min，此切片后經(jīng)DAB底物顯色、蘇木素復染以及1％鹽酸酒精分化處理后，將切片置于顯微鏡下觀察及照相。計算陽性細胞及陰性細胞比率，分為 “-、+、、”4個等級，分別表示為陽性細胞比率≤10％、 11％～40％、41％～70％、>70％。

1.3細胞培養(yǎng) 胃癌細胞株低分化黏液腺癌(MGC803)和中分化腺癌(SGC7901)為本室保存、低分化癌(AGS)購自上海市中科院細胞庫。細胞用含體積分數(shù)為10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、含體積分數(shù)為5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層生長，鋪滿培養(yǎng)瓶約80％～90％時傳代。傳代時常規(guī)吸去培養(yǎng)液，用含0.25％胰酶細胞消化液消化，在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即傾去胰酶細胞消化液，加適量含血清培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，按所需濃度接種。

1.4Western印跡 二喹啉甲酸(BCA)法測定細胞蛋白質(zhì)含量。CD44、ABCG2表達檢測：細胞裂解，收集蛋白，變性后經(jīng)10％十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5％牛血清白蛋白的Tris鹽酸緩沖液(TBST)(Tris-HCL 20 mmol/L，NaCl 137 mmol/L 含0.1％ Tween-20)封閉1 h，用CD44、ABCG2一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，5 min/次，相應的二抗孵育1 h，TBST洗3次，5 min/次，化學發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間率的比較用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CD44及ABCG2的表達 CD44陽性表達呈棕黃色，主要位于細胞膜，ABCG2主要定位于細胞質(zhì)，陽性表達呈明顯的棕黃色顆粒。CD44蛋白在癌旁胃黏膜中的陽性率為0，在慢性胃炎組織中的陽性表達率為18.75％(3/16)，在胃癌組織中陽性表達率60％(24/40)。胃癌組織中的陽性表達率顯著高于慢性胃炎組織及癌旁組織(P<0.05)；ABCG2在慢性胃炎及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為25％(4/16)和4.54％(1/22)，而在胃癌組織中的陽性表達率可達75％(30/40)顯著高于慢性胃炎組織及癌旁組織(P<0.05)。而癌旁胃黏膜ABCG2的陽性表達率與慢性胃炎組織也存在顯著性差異(P<0.05)。ABCG2蛋白在不同分化程度癌細胞中的表達率均有明顯差異，ABCG2蛋白在不同分化程度腺癌中的表達率順序為低分化>中分化>高分化，表達率分別為89.47％(17/19)、63.64％(7/11)、40％(4/10)，各組比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 胃癌組織中CD44及ABCG2蛋白的表達(SP，×40)

表1胃腺癌、慢性胃炎和正常胃黏膜組織中ABCG2、CD44的表達(n)

與癌旁胃黏膜組比較：1)P<0.05；與慢性胃炎組比較：2)P<0.05

2.2CD44和ABCG2的相關(guān)性 ABCG2蛋白陽性表達的30例胃癌標本中有20例(66.7％)CD44陽性表達；高于ABCG2陰性標本中CD44陽性表達率〔2例(20％)〕。CD44與ABCG2蛋白之間呈正相關(guān)(r=0.94，P<0.05)。

2.3Western印跡結(jié)果 CD44和ABCG2蛋白在AGS、SGC7901、MGC803細胞中均有明顯表達，其中CD44蛋白在三株細胞中的光密度值分別為(0.81±0.05)、(0.82±0.04)、(0.84±0.06)，ABCG2蛋白在三株細胞中的光密度值分別是(0.75±0.04)、(0.76±0.03)、(0.78±0.06)；組間比較，三株細胞中的表達均無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

1:AGS細胞；2：SGC 7901細胞；3：MGC803細胞

3 討 論

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國胃癌死亡率呈上升趨勢，多發(fā)人群年齡段為50～80歲〔4，5〕。胃癌生物學行為的相關(guān)研究是近年研究的熱點及亟待突破點。CD44及 ABCG2可能成為胃癌診斷和治療的標志物。

CD44蛋白為細胞表面的組成成分，在許多腫瘤細胞表面都可表達，如肺癌、口腔癌、肝癌、大腸癌、宮頸癌等，其作用機理是通過直接或替代途徑增強了多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，是參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要物質(zhì)〔6，7〕。大量研究表明，CD44 可用于識別胃癌干細胞，CD44表達與胃癌的發(fā)生有明顯相關(guān)性。CD44可作為胃癌干細胞的標志物應用于對胃癌干細胞的識別，并且越來越多的研究指向CD44在腫瘤的浸潤與發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究說明CD44參與胃癌變過程。本研究中發(fā)現(xiàn)，CD44不僅與胃癌發(fā)生過程有關(guān)聯(lián)，CD44蛋白的高表達也與腫瘤的分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

ABCG2 在具備腫瘤干細胞特性的側(cè)群(SP)細胞中高表達，被認為是分離 SP 表型細胞的重要標志物〔8〕。SP 細胞的重要作用體現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及藥物耐受等方面。ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白作為腫瘤干細胞表面標記目前受到廣泛關(guān)注。Wang等〔9，10〕在宮頸癌、胰腺癌、肝癌等細胞株中均成功分離出ABCG2為陽性的細胞，其具有典型的干細胞特征。對ABCG2在胃癌中的表達研究，有助于發(fā)現(xiàn)胃癌干細胞的表面標記，從而顯著優(yōu)化胃癌的治療效果，同時能對研究胃癌的發(fā)生機制有著積極的促進作用及重要意義。本研究結(jié)果說明ABCG2參與胃癌的發(fā)生過程。ABCG2蛋白表達隨著分化程度逐漸降低呈現(xiàn)升高趨勢。目前研究發(fā)現(xiàn)，大部分胃癌組織都為單獨表達CD44或ABCG2，但也有研究發(fā)現(xiàn)癌組織同時有CD44及ABCG2的升高。

綜上所述，CD44是胃癌干細胞的標志物，在胃癌變過程中有表達升高現(xiàn)象，CD44可能參與胃癌的發(fā)生。其白作為SP 細胞特異性表面標志物，ABCG2的表達與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。在胃癌的發(fā)生、進展中ABCG2和CD44可能起到一定的協(xié)同作用，針對兩者關(guān)系進行全面檢測具有重要意義，一方面對于胃癌早期診斷，ABCG2和CD44是重要的檢測指標；另一方面對于胃癌治療效果，ABCG2和CD44的表達可以作為重要的評判依據(jù)。

4 參考文獻

1Saka M，Morita S，F(xiàn)ukagawa T，etal.Present and future status of gastric cancer surgery〔J〕.Jap J Clin Oncol，2011；41(3)：307-13.

2Yasui W，Sentani K，Sakamoto N，etal.Molecular pathology of gastric cancer：research and practice〔J〕.Pathol Res Pract，2011；207(10)：608-12.

3擺 斌.胃癌中MTA2，MMP-7和MMP-14的表達關(guān)系〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(13)：3085-7.

4雷大釗，黃炯強，雷 建，等.老年胃癌的臨床病理特征〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(1)：82-4.

5鐘武裝，肖麗萍，蔡敏捷.早期腸內(nèi)營養(yǎng)對老年胃癌患者術(shù)后免疫功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(2)：280-2.

6Zhang C，Li C，He F，etal.Identification of CD44+，CD24+gastric cancer stem cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2011；137(11)：1679-86.

7Henry JC，Park JK，Jiang J，etal.miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2010；403(1)：120-5.

8Ni Z，Bikadi Z，Rosenberg MF，etal.Structure and function of the human breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2)〔J〕.Curr Drug Metab，2010；11(7)：603-17.

9Wang YH，Li F，Luo B.A side population o f cells from a human pancreatic carcinom a cell line harbors cancer stem cell characteristics〔J〕.Neoplasma，2009；56(5)：371-8.

10劉 晨，安曉霞，張 凡，等.腫瘤干細胞相關(guān)基因ABCB1、ABCG2表達與宮頸上皮惡變及發(fā)展關(guān)系的研究〔J〕.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2012；21(4)：294-7.