宋冬晶 劉 斌 劉新宇 王 曄 王德生 紀 勇

(哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

神經(jīng)顆粒素(Ng)是特異性神經(jīng)元突觸后膜蛋白，是神經(jīng)可塑性及學習記憶調控過程中的一個重要蛋白，其基因表達和蛋白質合成主要分布于海馬、前額皮層、紋狀體和杏仁核〔1〕。作為突觸后蛋白激酶(PK)C的作用底物和Ca2+敏感性鈣調蛋白(CaM)結合蛋白，Ng主要通過調控Ca2+和CaM依賴性酶包括Ca2+- CaM依賴性蛋白激酶(CaMK)Ⅱ等，參與學習記憶過程〔2～6〕。本文通過觀察復智散對轉基因阿爾茨海默病(AD)小鼠腦神經(jīng)細胞內Ng通路的影響，探討復智散治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組 6月齡APP/PS1 雙重轉基因小鼠，購自南京大學模式動物研究所。正常對照組為15只相同遺傳背景同月齡的C57BL/6J小鼠。實驗隨機分為對照組(蒸餾水23 ml/d)、模型組(蒸餾水23 ml/d)、低劑量組(1.25 g/kg)、中劑量組(2.5 g/kg)、高劑量組(5.0 g/kg)、安理申組(0.54 mg·kg-1·d-1)，各組15只。連續(xù)灌胃21 d。

1.2藥物 復智散(FZS)，哈醫(yī)大一院王德生教授研發(fā)，由人參、節(jié)菖、蒲黃芩等八味中草藥組方而成。水浸泡40 min，煎煮1 h，過濾出藥汁。加水煎煮40 min后再次過濾，將兩次濾過的藥汁混合，配制成FZS濃度為0.25 g生藥/ml的提取液，于4℃保存。安理申(鹽酸多奈哌齊)，5 mg/片，購自衛(wèi)材藥業(yè)。

1.3Western印跡檢測蛋白表達量 腦組織剪至約150 mg，加300 μl蛋白質抽提液，勻漿。最高速度漩渦振蕩5 s。12 000 r/min，4℃離心5 min。迅速把上清液轉移至另外一個預冷的離心管，-20℃保存。加樣到96孔板，標準品稀釋液調整最終量到20 μl；A570 nm波長下檢測OD配平各組蛋白；1∶4的比例加入SDS-PAGE5倍上樣緩沖液，水煮，直至蛋白質變性電泳分析。曝光顯影。

2 結 果

2.1行為學實驗結果 模型組潛伏期明顯長于對照組(P<0.01)；各用藥組潛伏期均有不同程度改善，中劑量組和安理申組的潛伏期明顯短于模型組(P<0.01)，中劑量組與安理申組比較無顯著性差異(P>0.05)。模型組小鼠電擊時間明顯長于對照組(P<0.01)；各用藥組的電擊時間均短于模型組，其中中劑量組、安理申組最明顯(P<0.01)，而中劑量組與安理申組電擊時間比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠行為學實驗結果比較

2.2小鼠海馬Ng信號通路表達水平變化 模型組鼠Ng蛋白表達量較對照組顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，安理申組、高劑量組、中劑量組、低劑量組Ng 蛋白均有不同程度增高，其中安理申組、中劑量組變化最明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 或P<0.01)，中劑量組優(yōu)于安理申組。

對照組Aβ、APP、BACE 和PS-1蛋白表達量較低；模型組轉基因小鼠腦細胞內APP蛋白表達量較對照組APP蛋白表達量明顯增多，其中Aβ、BACE 和PS-1蛋白表達增加更顯著(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，安理申組、高劑量組、中劑量組、低劑量組APP的蛋白表達量均有不同程度降低，其中安理申組、中劑量組變化最明顯(P<0.05或P<0.01)。APP、BACE和PS-1蛋白表達量安理申組與中劑量組無顯著差異。復智散中劑量組Aβ蛋白表達明顯低于安理申組(P<0.05)。

3 討 論

生理狀態(tài)下，Ng與CaM結合形成復合體，當神經(jīng)沖動引起NMDAR活化，與受體偶聯(lián)的Ca2+通道開放，細胞內Ca2+濃度升高，Ng與CaM復合體解離，游離Ng被PKC磷酸化，與CaM親和力降低，細胞內Ca2+與CaM復合體濃度增加，激活Ca2+和CaM依賴性酶，如CaM依賴性NO合酶、CaMKⅡ及CaM依賴性腺苷酸環(huán)化酶AC1、AC8等，這些酶均參與LTP的誘導和維持，因此Ng是調控學習和記憶過程的重要蛋白。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Ng基因敲除的小鼠海馬LTP明顯受損，空間學習能力受損，提示了Ng在學習記憶過程中的重要作用〔7～9〕。

實驗證實，Ng主要是通過促進依賴于Ca2+的信號轉導途徑提高海馬LTP和學習記憶能力〔10〕，即神經(jīng)元內Ng濃度越高，Ng-CaM復合體的形成越多，Ng可被視為神經(jīng)元內CaM的儲庫。因而當Ca2+流入細胞內，將有更多的CaM與Ca2+結合，有利于激活Ca2+與Ca2+-CaM依賴的信號級聯(lián)反應，包括PKC、CaMKⅡ。最近，有研究進一步證實Ng作為記憶形成機制的上游調控子，通過調控游離的Ca2+和CaM，在PKC介導的信號轉導途徑中起關鍵作用。

模型組鼠海馬NMDAR的關鍵亞基NR1表達水平降低，這可能是認知功能下降的原因之一。AD鼠海馬和前額皮層Ng蛋白表達水平下降。同時，Ng信號轉導途徑中的兩個關鍵酶PKC和CaMK水平也明顯下降。提示AD可能通過影響中樞重要腦區(qū)中以Ng為上游調控子的信號轉導通路損害機體的學習記憶功能；FZS可通過提高Ng通路蛋白表達而改善AD鼠的認知功能。

4 參考文獻

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