應(yīng) 隆 徐麗歌 應(yīng) 倩

(白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000)

黃褐斑發(fā)病率較高，好發(fā)于青年女性，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與精神壓力、紫外線照射、婦科疾病、內(nèi)分泌紊亂以及女性大量使用避孕藥、化妝品有關(guān)。近年來(lái)，對(duì)該病的研究較多，但對(duì)其病因及病變機(jī)理未得到任何實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，臨床治療多以中醫(yī)驗(yàn)方內(nèi)服外敷為主。甘草苷(LQ)為中藥甘草中的主要成分，有保肝、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等生物活性。本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)采用小鼠體外紫外線局部照射，體內(nèi)雌激素注射的方法制造黃褐斑模型，用LQ進(jìn)行干預(yù)治療，觀察LQ對(duì)黃褐斑模型小鼠抗氧化，抗黃褐斑的作用，在體外以人黑素瘤A375細(xì)胞株為模型，觀察LQ對(duì)人黑素瘤細(xì)胞株A375增殖的影響，在動(dòng)物整體及細(xì)胞水平研究LQ對(duì)黃褐斑的治療作用及機(jī)制，為中藥治療黃褐斑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1動(dòng)物及細(xì)胞株 昆明種雌性SPF級(jí)小鼠60只，體重(30±2)g，吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。人黑素瘤A375細(xì)胞株，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2藥品試劑 LQ，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：201002；黃體酮注射液，10 mg/ml，批號(hào)100407,山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，Gibco公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組、模型制備 小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、LQ低劑量組(15 mg·kg-1·d-1)、LQ中劑量組(30 mg·kg-1·d-1)、LQ高劑量組(60 mg·kg-1·d-1)和維生素C組。空白對(duì)照組肌肉注射生理鹽水(2 ml·kg-1·d-1)，其余各組肌肉注射黃體酮注射液(20 mg·kg-1·d-1)。同時(shí)，各組小鼠背部脫毛，面積約2×2 cm2，除正常組外，其余各組照射紫外線1次/d，紫外線波長(zhǎng)315 nm，30 min/次，小鼠距光源垂直距離20 cm，連續(xù)30 d。

1.3.2給藥方法 造模同時(shí)，空白對(duì)照組、模型組給予生理鹽水灌胃(0.5 ml/d)，LQ各劑量組給予相應(yīng)LQ雙蒸水溶液灌胃(0.5 ml/d)，維生素C組給予維生素C水溶液(0.5 ml/d)，1次/d，連續(xù)30 d。

1.3.3取材及指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第31天，各組小鼠麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清。取經(jīng)紫外線照射的脫毛部位皮膚，生理鹽水中漂洗，取0.5 g全層皮膚，用眼科剪剪碎，加入4 ml生理鹽水，冰浴勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清。按試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定血清及皮膚組織中SOD、MDA等的含量。

1.3.4作用于A375人黑素瘤細(xì)胞增殖的影響 采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)，取A375人黑素瘤對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，濃度5×104/ml，接種于96孔板中，100 μl/孔。放置CO2培養(yǎng)箱24 h，棄去上清，加入濃度為0.1，1，10 μmol/L LQ的培養(yǎng)基，100 μl/孔，培養(yǎng)48 h。加入濃度為5 mg/ml MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h，棄上清。每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl。振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率(％)=(1-A給藥組/A對(duì)照組)×100％。

2 結(jié) 果

2.1LQ對(duì)黃褐斑模型小鼠血清中SOD、MDA、NO含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組MDA含量顯著升高，SOD、NO含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。 與模型組相比，LQ中、高劑量組血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)。LQ低、中、高劑量組血清中SOD含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，呈劑量依賴性。LQ中、高劑量組血清中NO含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 LQ對(duì)黃褐斑模型小鼠血清中SOD、MDA、NO含量的影響

2.2LQ對(duì)黃褐斑模型小鼠皮膚組織中SOD、MDA、NO含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組MDA含量顯著升高，SOD、NO含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，LQ低、中、高劑量組組皮膚中MDA含量顯著降低(P<0.05)。LQ 高劑量組皮膚中SOD含量顯著升高(P<0.05)，有顯著差異。LQ中劑量組皮膚中NO含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 LQ對(duì)黃褐斑模型小鼠皮膚組織中SOD、MDA、NO含量的影響

2.3LQ對(duì)A人黑素瘤375細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組(OD值0.619±0.137)相比，LQ 1，10 μmol/L組對(duì)A375人黑素瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(OD值分別為0.492±0.109,0.468±0.117)(P<0.05)，其抑制率分別為20.52％，24.39％。而LQ 0.1 μmol/L抑制率為13.25％，OD值0.537±0.091。

3 討 論

黃褐斑好發(fā)于中、青年女性，中醫(yī)認(rèn)為“由憂思抑郁，血弱不華，火燥結(jié)滯而生于面上〔1〕。”黃褐斑的發(fā)生是全身系統(tǒng)的血?dú)?、臟腑、經(jīng)絡(luò)失調(diào)的局部體現(xiàn)，肝腎虧虛，氣滯血瘀，最終導(dǎo)致面部皮膚失去養(yǎng)分，喪失潤(rùn)澤誘發(fā)色斑。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃褐斑是由人體黑色素生成異常，其發(fā)生機(jī)制有多種原因形成，如紫外線等理化因素刺激、氧化應(yīng)激失衡、內(nèi)分泌失調(diào)〔2〕、血流變學(xué)異常、肝臟等慢性疾病〔3〕、失眠等神經(jīng)因素〔4〕等。而氧化與抗氧化的失衡，是黃褐斑公認(rèn)的主要誘因。當(dāng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，氧自由基增多時(shí)，體內(nèi)的SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)、GSH-Px等就會(huì)增加，清除多余的氧自由基，使機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于動(dòng)態(tài)的平衡。黃褐斑的患者氧化應(yīng)激系統(tǒng)障礙，使體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)不隨脂質(zhì)過(guò)氧化物的增多而增強(qiáng)，過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化物加速酪氨酸氧化，形成黑色素增多。LQ能明顯降低黃褐斑模型小鼠血清中MDA含量，升高SOD、NO活性，同時(shí)，能顯著提高黃褐斑模型小鼠皮膚中SOD活性，降低MDA含量，延緩模型小鼠的皮膚黑色素的沉積。A375為人皮膚黑素瘤細(xì)胞株，其黑素合成功能與人體正常皮膚黑素細(xì)胞基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LQ可以抑制黑素細(xì)胞的增殖，從而抑制黑素的合成，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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3陳志偉，丁愛國(guó)，聶小玲.女性黃褐斑患者的甲狀腺功能測(cè)定〔J〕.中華皮膚科雜志，2005；38(11):704-5.

4林新瑜，羅旭松，向雪岑，等.150例黃褐斑患者發(fā)病因素的統(tǒng)計(jì)分析〔J〕.華西醫(yī)學(xué)，2003；18(3):329-30.