劉 剛 李 暢 曹雅東 任 強(qiáng) 陳為龍 朱海超 盧英強(qiáng)

(吉林省公安廳，吉林 長(zhǎng)春 130000)

老年患者慢性腦缺氧與神經(jīng)細(xì)胞變性疾病密切相關(guān)。P53作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一系列基因的表達(dá)，其靶基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞老化、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡的發(fā)生中發(fā)揮重要作用〔1,2〕。本研究小鼠腦缺氧后不同時(shí)間段P53表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型建立 雄性昆明系小鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照及腦缺氧組。腦缺氧組分別于術(shù)后2、8、24 h、1、3、6、9、12、16 d處死，共10組。手術(shù)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，10％水合氯醛(0.35 g/kg體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，剪去頸部皮毛，消毒皮膚后沿中線切開(kāi)皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈后，結(jié)扎后縫合皮膚，置鼠籠喂養(yǎng)。正常對(duì)照組僅切開(kāi)頸部皮膚，但并不結(jié)扎動(dòng)脈。

1.2方法

1.2.1HE染色 腦組織標(biāo)本用10％甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。

1.2.2免疫組化染色檢測(cè)P53 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用已知陽(yáng)性的切片做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗為陰性對(duì)照。采用CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)平均灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色 腦缺氧2 h后，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞尼氏體溶解消失，損傷灶周?chē)窠?jīng)細(xì)胞尼氏體溶解消失，并伴有周?chē)g隙增寬，呈腦水腫改變。缺氧24 h后，腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死。缺氧120 h后，可見(jiàn)有小膠質(zhì)細(xì)胞增生。

2.2顱腦損傷后隨時(shí)間變化P53表達(dá) 在正常頸動(dòng)脈未結(jié)扎腦組織中，P53表達(dá)量較少；P53在顱腦損傷8 h后表達(dá)增高，表現(xiàn)為平均灰度值增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)后持續(xù)增高，缺氧3 d后達(dá)峰值。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 小鼠大腦缺氧后P53隨時(shí)間表達(dá)變化

圖2 小鼠大腦缺氧后P53免疫組織化學(xué)表達(dá)變化

3 討 論

P53是早期發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因之一，50％以上的惡性腫瘤P53基因會(huì)發(fā)生突變。Rubbi采用UV照射誘發(fā)DNA損傷而激活P53，他們發(fā)現(xiàn)P53激活后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。其分子機(jī)制為當(dāng)雙鏈DNA損傷后，會(huì)抑制RNA聚合酶(Pol)Ⅰ的組裝，進(jìn)而導(dǎo)致RPL5和RPL11從核仁中釋放出來(lái)。MDM2是P53特異性E3泛素化連接酶，可特異性介導(dǎo)P53泛素化降解，而從核仁中釋放出的RPL5和RPL11可結(jié)合MDM2，拮抗其對(duì)P53的降解，從而穩(wěn)定P53導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)P53表達(dá)水平增加，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔3〕。P53作為重要的凋亡參與因子，其在發(fā)育過(guò)程及組織修復(fù)重構(gòu)方面的重要作用也日益受到學(xué)者們的重視〔4〕。

腦組織缺氧后，可引起一系列嚴(yán)重的臨床癥狀，腦組織的長(zhǎng)期慢性缺氧與老年患者神經(jīng)退行性變的發(fā)生密切相關(guān)，而凋亡過(guò)程無(wú)疑在神經(jīng)細(xì)胞退行性變的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。P53作為重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，其在腦組織缺氧后的原位表達(dá)變化研究卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常腦組織中，P53表達(dá)量未見(jiàn)表達(dá)，說(shuō)明正常情況下P53表達(dá)量較少，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)后持續(xù)增高。意味著P53可作為有效的免疫組織化學(xué)指標(biāo)，在腦缺氧的臨床診斷方面具有重要意義。

4 參考文獻(xiàn)

1Lujambio A,Akkari L,Simon J,etal.Non-cell-autonomous tumor suppression by p53〔J〕.Cell,2013;153(3):449-60.

2Munoz-Espin D,Canamero M,Maraver A,etal.Programmed cell senescence during mammalian embryonic development〔J〕.Cell,2013;155:1104-18.

3Rubbi CP,Milner J.Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses〔J〕.EMBO J,2003;22:6068-77.

4Tollini LA,Jin A,Park J,etal.Regulation of p53 by Mdm2 E3 ligase function is dispensable in embryogenesis and development,but essential in response to DNA damage〔J〕.Cancer Cell,2014;26(3):235-47.