紀(jì)朋艷 田 晶 任 曠 王艷春 齊 玲 劉曉陽

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的46％，盡管采取手術(shù)、放、化療等方法，惡性膠質(zhì)瘤患者的中位生存期仍徘徊在1年左右。因此，探索新的更為有效的膠質(zhì)瘤治療方法、治療藥物是一熱點(diǎn)課題〔1,2〕。氯通道阻斷劑應(yīng)用于臨床的前景看好〔3〕。5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)是常用的氯通道阻斷劑，其對大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究觀察了不同濃度NPPB對體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的作用并初步探討其作用機(jī)制，旨在探討通過阻斷氯通道達(dá)到控制膠質(zhì)瘤生長的可能性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2藥物及試劑 NPPB(美國Sigma公司)加入二甲基亞砜(DMSO)配制成終濃度為0.1 mol/L的原液，過濾后-20℃保存?zhèn)溆茫凰募谆嫉蛩{(lán)(MTT)購自美國Sigma公司；RPMI-1640購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、小牛血清購自美國Gibco公司；Bax、Bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3抗體購自北京中杉公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 自-80℃冰箱中取出大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞迅速置于37℃水浴至融化，離心后小心吸出上清，細(xì)胞接種于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5％ CO2，飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長良好，待 80％～90％融合時進(jìn)行傳代。

1.4MTT法檢測NPPB對C6細(xì)胞生長的影響 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化，用含5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至5×104/ml，接種于96孔板，100 μl/孔。37℃、5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，藥物組分別用濃度為20、40、80、160 μmol/L的NPPB液200 μl處理；陰性對照組和調(diào)零組加入5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基200 μl，各設(shè)復(fù)孔3個。分別培養(yǎng)細(xì)胞12、24、48 h后，加入5 μg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出96 孔板，每孔加入(DSMO)150 μl振蕩20 min，使結(jié)晶完全溶解，自動酶標(biāo)儀測定各孔490 nm 處的吸光度值(A490)，以不加細(xì)胞的調(diào)零孔調(diào)零。細(xì)胞相對活力(％)=用藥組A值/對照組A值×100％。

1.5ELISA法測定C6細(xì)胞培養(yǎng)上清中Bax、Bcl-2和Caspase-3 表達(dá)水平 取生長狀態(tài)良好的C6細(xì)胞，按5×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，1 ml/孔。藥物組分別加入40、80、160 μmol/L的NPPB處理48 h，每組設(shè)3個復(fù)孔，空白對照組加入5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。取培養(yǎng)上清包被96孔酶標(biāo)板，4℃過液，封閉后加入Bcl-2和Caspase-3 抗體(1∶200稀釋)4℃過夜，次日二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，當(dāng)有顏色變化時加入終止液。自動酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度(A)值，以空白對照組(無細(xì)胞)調(diào)零。表達(dá)水平以A值表示。

2 結(jié) 果

2.1NPPB對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響 見表1。藥物作用12 h后，與對照組相比，各NPPB濃度組均能提高細(xì)胞相對活力，促進(jìn)細(xì)胞的生長，其中40、80、160 μmol/L能明顯促進(jìn)C6細(xì)胞的生長(P<0.05)；藥物作用24 h后，與對照組相比各濃度組均能顯著提高細(xì)胞相對活力(P<0.05)；藥物作用48 h后，各濃度組的細(xì)胞相對活力下降，抑制細(xì)胞生長。其中40、80、160 μmol/L NPPB作用48 h后細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)，且作用呈濃度依賴性。

表1 NPPB對C6細(xì)胞增殖作用的影響

2.2NPPB對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白的影響 不同濃度組NPPB作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，各用藥組Bax蛋白分泌呈上升趨勢，80、160 μmol/L濃度組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bcl-2蛋白分泌都呈下降趨勢，80、160 μmol/L濃度組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bax/Bcl-2比值隨藥物濃度的升高而升高，160 μmol/L濃度組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各濃度組Caspase-3蛋白水平升高，與對照組相比80、160 μmol/L濃度組有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 NPPB對C6細(xì)胞分泌Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平的影響

3 討 論

氯離子通道分布十分廣泛，在機(jī)體內(nèi)具有非常重要的作用，可以對抗細(xì)胞外液滲透壓的影響、維持膜電位、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，且在細(xì)胞增殖分化、凋亡、侵襲等過程中起著重要作用〔4，5〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，氯離子通道與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),其在腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞周期、凋亡調(diào)控以及細(xì)胞遷移過程中具有重要的作用，有望成為抗腫瘤新靶點(diǎn)〔6，7〕。

NPPB屬芳香族酸類容量敏感性氯通道阻斷劑。據(jù)報道，NPPB能夠提高細(xì)胞活力，50 μmol/L的NPPB能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2Z)細(xì)胞的凋亡〔8〕，100 μmol/L的NPPB作用20 h后可以減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷〔9〕，加入NPPB后能夠不同程度地拮抗抗癌藥物的抗增殖作用〔10〕。Wondergem等〔11〕的結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 μmol/L NPPB作用48 h可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,是導(dǎo)致細(xì)胞生存率下降的主要原因。馬建軍等〔12〕的研究表明50、100 μmol/L NPPB對腎癌細(xì)胞系作用48、72、96 h生長的抑制作用明顯。此外NPPB作用48 h后，當(dāng)培養(yǎng)液中的NPPB濃度達(dá)到60 μmol/L時,細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組〔13〕。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，NPPB發(fā)揮其抑制細(xì)胞生長的作用占優(yōu)勢。這也提示研究NPPB的作用要考慮時間的影響。

細(xì)胞凋亡的過程是復(fù)雜而多途徑的，凋亡信息通過一系列信息傳導(dǎo)通路到細(xì)胞而啟動細(xì)胞凋亡的。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中有重要的作用，是目前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)之一。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白。Bax主要是通過其自身形成的Bax同二聚體和(或)與Bcl-2形成異二聚體而調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，Bax/Bcl-2蛋白的比例關(guān)系是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。本研究提示在NPPB抑制細(xì)胞活力的過程中，促凋亡因素占據(jù)優(yōu)勢地位，抑凋亡因素下降，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Caspase-3在凋亡反應(yīng)的過程中起著非常關(guān)鍵的作用，是一種重要的促凋亡因子，Caspase-3的高表達(dá)能顯著提高誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果?？傊?，NPPB短時間作用后可以促進(jìn)C6細(xì)胞的生長，長時間作用后可以抑制C6細(xì)胞的生長，抑制生長的機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax蛋白，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，使Bax/Bcl-2比值升高，從而激活下游的Caspase-3蛋白表達(dá)增加，使C6細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 參考文獻(xiàn)

1Taylor JW,Chi AS,Cahill DP.Tailored therapy in diffuse gliomas:using molecular classifiers to optimize clinical managenment〔J〕. Oncology(Williston Park),2013;27(6):504-14.

2Wang Y,Jiang T. Understanding high grade glioma:molecular mechanism,therapy and comprehensive management〔J〕.Cancer Lett,2013;331(2):139-46.

3周士勝. 氯通道阻斷劑:離臨床應(yīng)用還有多遠(yuǎn)〔J〕. 大連大學(xué)學(xué)報,2006;27(6):72-4.

4Hasegawa Y,Shimizu T,Takahashi N,etal. The apoptotic volume decrease is an upstream event of Map kinase activation during staurosporine induced apoptosis in Hela cells〔J〕. Int J Mol Sci,2012;13(7):9363-97.

5He D,Luo X,Wei WJ,etal. DCPIB,a specific inhibitor of volume-regulated anion channels(VRACs),inhibits astrocyte proliferation and cell cycle progression via G1/S arrest〔J〕. J Mol Neurosci,2012;46(2):249-57.

6Zuo W,Zhu L,Bai Z,etal. Chloride channels involve in hydrogen Peroxide-induced apoptosis of PC12 cells〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2009;387(4):666-70.

7Mao J,Chen L,Xu B,etal. Volume-activated chloride channels contribute to cell-cycle-dependent regulation of HeLe cell migration〔J〕. Biochem Phamacol,2009;77(2):159-68.

8范愛輝,陳麗新,毛建文,等. 阻斷氯通道對鼻咽癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的影響〔J〕. 廣東醫(yī)學(xué),2006;27(12):1804-6.

9孔曉霞,張宏宇,李 揚(yáng),等. NPPB和尼弗滅酸對H2O2損傷C6膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸半胱氨酸合成酶及CLIC4表達(dá)的影響〔J〕. 中國病理生理雜志，2008;24(10):1962-5.

10Ise T,Shimizu T,Lee EL,etal. Roles of volume-sensitive Cl-channel in cisplatin-induced apoptosis in human epidermoid cancer cells〔J〕. J Membr Biol,2005;205(3):139-45.

11Wondergem R,Gong W,Monen SH,etal.Blocking swelling-activated chloride current inhibits mouse liver cell proliferation〔J〕.J Physiol,2001;532(Pt3):661-72.

12馬建軍,周士勝,保庭毅,等.氯通道阻斷劑NPPB對腎癌細(xì)胞系GRC-21生長的抑制作用〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003;24(9):822-4.

13田 晶,周士勝,陶 凌,等. NPPB對肝癌細(xì)胞增殖的影響〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003;25(2):63-5.