周紅麗 馬 艷 崔向飛

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

目前關(guān)于腎臟衰老的機(jī)制尚不十分明確。腎臟衰老主要是由于腎臟固有細(xì)胞功能減退所致。腎小球系膜細(xì)胞是腎臟的主要固有細(xì)胞，其表型和功能改變?cè)谀I臟衰老進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。研究證實(shí)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可促進(jìn)細(xì)胞衰老，這些研究多見(jiàn)于臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等〔1，2〕，對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞(GMC)衰老的研究報(bào)道甚少。本文探討AngⅡ在GMC衰老過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人GMC購(gòu)于美國(guó)sciencell公司。4201人系膜細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)sciencell公司)，細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色試劑盒(上海杰美基因有限公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)、AngⅡ(美國(guó)sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640(美國(guó)Gibco公司)，PI(上海晶美生物公司)。

1.2GMC傳代培養(yǎng) GMC貼壁生長(zhǎng)于含2％胎牛血清的專用HGMC培養(yǎng)液中，在5％CO2、37℃和完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。取5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3AngⅡ誘導(dǎo)人GMC衰老濃度的確定 ①衰老組：用10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L AngⅡ刺激人GMC，刺激時(shí)間24、48、72、96 h；②對(duì)照組：細(xì)胞在不含任何刺激因素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取密度為103個(gè)/孔的GMC接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞同步化12 h。對(duì)照組(6孔)每孔加入100 μl培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組(6孔)每孔加入含不同濃度AngⅡ培養(yǎng)液100 μl，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間。終止培養(yǎng)前每孔加入MTT 10 μl培養(yǎng)4 h，最后加入150 μl DMSO,振蕩10 min后,酶標(biāo)比色儀490 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果以吸光度值(OD)表示。以O(shè)D值的百分比代表存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 用0.25％的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液。800 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗2次。加入70％冷乙醇4℃固定過(guò)夜，離心去乙醇。PBS緩沖液洗2次后，懸浮于0.5 ml PBS緩沖液中，分別加入Rnase PI 4℃避光顯色30 min，上流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)及分析。

1.6細(xì)胞衰老SAβ-gal染色 PBS緩沖液清洗細(xì)胞1次，按細(xì)胞衰老SAβ-gal染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，染色后37℃無(wú)CO2培養(yǎng)3～12 h，細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)綠色沉淀。衰老的細(xì)胞染色后呈藍(lán)綠色，鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野分別計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算SAβ-gal陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

1.7倒置顯微鏡及透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變 細(xì)胞PBS清洗2次后，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。0.25％胰酶消化后收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液(pH 7.4) 離心洗細(xì)胞2 次，棄上清液，加入4℃預(yù)冷的2.5％戊二醛固定4 h以上，PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min，1％鋨酸4℃后固定2 h，漂洗3次。室溫下用乙醇、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618浸透、包埋。超薄切片用醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色各10 min，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖情況 AngⅡ作用0～48 h促進(jìn)GMC增殖，72 h抑制細(xì)胞增殖。10-6mol/L AngⅡ刺激72 h，存活的細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的(81.09±4.52)％(P<0.05)；10-7、10-8mol/L AngⅡ刺激組，細(xì)胞存活數(shù)分別為對(duì)照組的(94.34±5.16)％，(94.13±5.12)％(P>0.05)；10-4、10-5mol/L Ang Ⅱ刺激組細(xì)胞存活數(shù)明顯下降，分別為對(duì)照組的(51.18±3.48)％，(59.13±3.12)％(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2SAβ-gal染色結(jié)果 10-7、10-6、10-5mol/L AngⅡ作用72 h后，SAβ-gal染色陽(yáng)性率分別為(23.03±0.91)％、(81.23±6.71)％、(92.10±6.48)％。10-6mol/L AngⅡ，80％以上的細(xì)胞為SAβ-gal染色陽(yáng)性，與對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.01)(圖2)。而10-5mol/L AngⅡ作用后SAβ-gal染色陽(yáng)性率達(dá)90％，但大部分細(xì)胞發(fā)生死亡。

2.3細(xì)胞周期檢測(cè) 10-7、10-6、10-5mol/L AngⅡ作用72 h后，G0～G1期細(xì)胞比例分別為(74.76±4.38)％，(86.52±5.23)％，(83.43±5.18)％； 10-6mol/L AngⅡ作用后80％以上的細(xì)胞進(jìn)入G0～G1期，與對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)。10-5mol/L AngⅡ作用后，雖然80％以上的細(xì)胞也進(jìn)入G0～G1期，但凋亡的細(xì)胞及細(xì)胞碎屑增多。

2.4衰老人GMC光鏡及電鏡超微結(jié)構(gòu)改變 正常GMC光鏡下呈單核、梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞排列規(guī)則；電鏡下細(xì)胞核膜平整、光滑，染色質(zhì)分布均勻。10-6mol/L AngⅡ誘導(dǎo)的衰老GMC光鏡下體積增大、胞質(zhì)區(qū)域增加，細(xì)胞呈多型核及雙核；電鏡下細(xì)胞核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)凝集、邊集，細(xì)胞質(zhì)空泡增多，出現(xiàn)髓樣溶酶體；提示10-6mol/L AngⅡ作為刺激因素，誘導(dǎo)的GMC進(jìn)入衰老期。

圖1 不同濃度AngⅡ作用后細(xì)胞增殖曲線

圖2 不同濃度AngⅡ作用72 h SAβ-gal染色結(jié)果(×100)

3 討 論

衰老腎臟的改變主要是由于其固有細(xì)胞的衰老引起的。腎小球系膜細(xì)胞是腎臟主要的固有細(xì)胞，也是腎小球中功能最活躍的細(xì)胞，具有分泌細(xì)胞基質(zhì)、產(chǎn)生細(xì)胞因子、支撐腎小球毛細(xì)血管叢、吞噬和清除大分子物質(zhì)及類似平滑肌細(xì)胞收縮的功能，參與腎小球血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)。腎小球系膜細(xì)胞表型和功能的改變?cè)谀I臟衰老進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。目前研究證實(shí)：AngⅡ作為刺激因素可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生衰老。但不同細(xì)胞采用的藥物刺激濃度和刺激時(shí)間不一致，且對(duì)人GMC衰老的研究報(bào)道較少。10-6mol/L AngⅡ作用48 h，10-7mol/L AngⅡ作用24 h后可誘導(dǎo)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生衰老〔2，3〕。

本實(shí)驗(yàn)采用AngⅡ作為刺激因素，誘導(dǎo)人GMC發(fā)生衰老。其中藥物作用濃度和時(shí)間是參考相關(guān)的文獻(xiàn)選擇的。細(xì)胞增殖能力喪失，細(xì)胞阻滯于G0～G1期及SAβ-gal染色陽(yáng)性是衰老細(xì)胞的特點(diǎn)。G0～G1期細(xì)胞比例增多及SAβ-gal活性增加是衰老細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志。因此，本實(shí)驗(yàn)選用SAβ-gal 陽(yáng)性細(xì)胞率及G0～G1期細(xì)胞比例達(dá)80％這兩個(gè)指標(biāo)鑒定衰老細(xì)胞。

本研究結(jié)果提示10-6mol/L AngⅡ刺激的GMC中有80％以上的細(xì)胞為SAβ-gal染色陽(yáng)性，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞阻滯于G0～G1期，S期及G2～M期趨于消失，表明細(xì)胞分裂減慢，細(xì)胞增殖能力逐漸喪失，細(xì)胞發(fā)生衰老。故將10-6mol/L AngⅡ作用72 h作為誘導(dǎo)人GMC衰老的最佳刺激因素。

研究表明細(xì)胞衰老時(shí)會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的變化，表現(xiàn)為〔3〕：①核：增大、染色深、核內(nèi)有包含物；②染色質(zhì)：凝聚、固縮、碎裂、溶解；③質(zhì)膜：黏度增加、流動(dòng)性降低；④細(xì)胞質(zhì)：色素積聚、空泡形成；⑤線粒體：數(shù)目減少、體積增大；⑥高爾基體碎裂，尼氏體消失；⑦包含物：糖原減少、脂肪積聚；⑧核膜：內(nèi)陷。本研究表明：應(yīng)用AngⅡ作為刺激因素誘導(dǎo)的衰老HGMC形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，排列不規(guī)則，胞體扁平，胞質(zhì)顆粒增多，細(xì)胞呈多型核、雙核生長(zhǎng)等改變。電鏡下顯示細(xì)胞核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)凝集、邊集，細(xì)胞質(zhì)空泡形成，出現(xiàn)髓樣溶酶體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。進(jìn)一步證實(shí)了10-6mol/L AngⅡ作用72h后GMC進(jìn)入了衰老狀態(tài)。

綜上，本研究證實(shí)，應(yīng)用AngⅡ?yàn)榇碳ひ蛩兀梢哉T導(dǎo)人GMC發(fā)生衰老，為研究防治腎臟衰老的方法提供思路。

4 參考文獻(xiàn)

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