王 凌 林 榮 潘國(guó)焰 吳 兵

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建 泉州 362000)

研究證實(shí)他汀類(lèi)藥物較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)應(yīng)用能減少缺血再灌注損傷，但關(guān)于他汀短期用藥尤其是單次負(fù)荷劑量療效的基礎(chǔ)研究甚少，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)前給予負(fù)荷劑量的某些他汀類(lèi)藥物治療可以減輕心肌損傷〔1〕，其機(jī)制推測(cè)部分可能與減輕缺血再灌注損傷有關(guān)；而有關(guān)單次負(fù)荷劑量瑞舒伐他汀缺血前預(yù)處理對(duì)再灌注損傷影響的基礎(chǔ)研究目前罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)再灌注前給予單次負(fù)荷劑量瑞舒伐他汀觀察其能否減輕在體家兔心肌缺血再灌注損傷，并探討其對(duì)再灌注損傷挽救激酶(RISK)信號(hào)通路的影響及潛在的心肌保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用84只健康成年雄性大耳白兔(由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重2.5～3.0 kg，兔齡120～140 d。

1.2主要制劑 瑞舒伐他汀鈣原粉(浙江昌明藥業(yè)有限公司)；TTC染色劑、伊文思藍(lán)、LY294002、PD98059(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，P-蛋白激酶B(Akt)、Akt、P-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、ERK1/2抗體(均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3制備兔缺血/再灌注模型 借鑒文獻(xiàn)〔2〕，將家兔麻醉后固定，連接LEAD2000多導(dǎo)生理儀記錄進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)并記錄肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。經(jīng)胸骨左緣2～4肋開(kāi)胸并剪開(kāi)心包，尋找冠狀動(dòng)脈左室支(多沿左心耳下行至心尖處)并于其近段附近以6～0細(xì)針線(xiàn)穿過(guò)左室支下方，進(jìn)針深度約0.3 mm，線(xiàn)兩側(cè)穿入同一根橡皮小管以形成閉環(huán)，拉緊閉環(huán)即造成冠脈閉塞，導(dǎo)致局部心肌缺血，直視下可觀察到左室支供血區(qū)域的心肌顏色由紅色變?yōu)榘祷疑?，左室下、后壁心肌搏?dòng)明顯減弱，同時(shí)心電圖出現(xiàn)明顯的ST段弓背向上型抬高(Ⅱ、Ⅲ、avF導(dǎo)聯(lián))，回撤松開(kāi)閉環(huán)即可使局部心肌恢復(fù)再灌注。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)均分成7組，每組12只。假手術(shù)組僅開(kāi)胸而不進(jìn)一步處理，術(shù)前12 h靜脈注射生理鹽水1 ml/只；對(duì)照組(缺血再灌注組)術(shù)前12 h靜脈注射生理鹽水1 ml/只；RS組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg(用生理鹽水溶解，溶成1 ml)；RS+LY294002組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射LY294002(0.3 mg/kg)；LY294002組再灌注前5 min靜脈注射LY294002(0.3 mg/kg)；RS+PD98059組術(shù)前12 h靜脈注射RS 5 mg/kg，再灌注前5 min注射PD98059(0.3 mg/kg)；PD98059組再灌注前5 min靜脈注射PD98059(0.3 mg/kg)。7組體重、兔齡無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

1.5觀察指標(biāo) ①心電圖。常規(guī)描記缺血前、缺血5、20、40 min和再灌注10、30、60、120、180 min時(shí)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)全程發(fā)生的各種心律失常情況。②心肌缺血范圍=梗死范圍測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束原位結(jié)扎左室支，抽取2％伊文思藍(lán)2～3 ml注入左心室，非缺血心肌被染成藍(lán)色，缺血區(qū)心肌因無(wú)灌注而不被染色(無(wú)藍(lán)染)。注射10％氯化鉀使心臟停搏并立即摘取心臟，仔細(xì)分離左心室染色區(qū)和非染色區(qū)，稱(chēng)重后將非染色區(qū)(缺血區(qū))置-20℃冰凍保存5 min后，沿左心室長(zhǎng)軸橫切為5～6片厚約2 mm的心肌片，先置于1％TTC磷酸緩沖液中，后置于37℃恒溫進(jìn)行水浴，缺血區(qū)因TTC被脫氫酶還原而呈現(xiàn)深紅色，梗死區(qū)因TTC無(wú)法被還原而呈灰白色，染色結(jié)束后用蒸餾水沖洗，隨后置于4％多聚甲醛中固定12 h，根據(jù)局部顏色差異進(jìn)一步將梗死區(qū)和非梗死區(qū)分離，吸干后分別稱(chēng)重。心肌缺血范圍以缺血區(qū)心肌重量/左室重量×100％，心肌梗死范圍=壞死區(qū)心肌重量/缺血區(qū)心肌重量×100％來(lái)表示。

1.6Western印跡法檢測(cè)Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表達(dá) 分離左心室缺血區(qū)心肌，用預(yù)冷PBS液洗滌后稱(chēng)取100 mg心肌組織，在液氮中研磨成粉末，加入1 ml單去污劑裂解液，充分裂解細(xì)胞后，置12 000 r/min離心15 min，分離收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肂CA蛋白定量試劑盒進(jìn)行心肌組織蛋白定量。各取50 μg待測(cè)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的Akt、P-Akt、ERK1/2、P-ERK1/2抗體(均為1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌后加入稀釋1：2 500的二抗室溫孵育1 h，洗滌瀝干后加入ECL Plus試劑進(jìn)行ECL顯影。最后用Leica圖像分析軟件測(cè)定圖片上每個(gè)特異性條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌缺血范圍及梗死范圍比較 與對(duì)照組比較，各組缺血心肌范圍均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；RS組心肌梗死范圍明顯降低(P<0.05)，其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心肌缺血范圍及梗死范圍比較

2.2各組Akt、P-Akt、ERK1/2及P-ERK1/2蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，對(duì)照組P-Akt、P-ERK1/2水平明顯增加(P<0.05)；RS組P-Akt、P-ERK1/2水平比對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；RS+LY294002、LY294002組P-Akt及RS+PD98059、PD98059組P-ERK1/2的水平較RS組均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

a.假手術(shù)組；b.對(duì)照組；c.RS組；d.RS+LY294002組；e.LY294002組；f.RS+PD98059組；g.PD98059組

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05；與RS組比較：3)P<0.05

3 討 論

瑞舒伐他汀是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)親水性他汀，相較其他他汀類(lèi)，其水溶性和降低低密度脂蛋白(LDL)的效果更強(qiáng)。Ke等〔7〕發(fā)現(xiàn)RS能通過(guò)誘導(dǎo)CD4、CD25調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)作用，Wu等〔8〕等近期發(fā)現(xiàn)單次負(fù)荷劑量RS能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和高遷移率族蛋白(HMGB)1，減少兔心梗面積。Jiang等〔9〕等發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者PCI術(shù)前單次負(fù)荷劑量的RS(40 mg/d)能有效抑制PCI術(shù)后再灌注心肌損傷，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

RISK信號(hào)通路是指一組促存活蛋白激酶，主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)，Akt和Erkl/2。PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活后可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，誘導(dǎo)內(nèi)皮型氧化亞氮合酶(eNOS)及調(diào)節(jié)p70s6K、糖原合成激酶-3B，抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制線(xiàn)粒體可滲透轉(zhuǎn)運(yùn)孔隙(mPTP)的開(kāi)放，或通過(guò)影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯而發(fā)揮作用。后者系絲裂素活化蛋白激酶家族中成員之一，激活后可通過(guò)磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，或觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)抗凋亡信號(hào)機(jī)制而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用〔10，11〕。目前的研究發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)系統(tǒng)的激活正是缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)所介導(dǎo)的心肌保護(hù)的重要機(jī)制〔12～14〕；Hausenloy等〔10〕對(duì)大鼠心肌進(jìn)行缺血預(yù)處理研究時(shí)發(fā)現(xiàn)再灌注前多次心肌缺血可誘導(dǎo)Akt和ERK1/2的磷酸化水平升高，并縮小心肌梗死面積，應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑抑制PI3K/Akt和ERK1/2磷酸化則無(wú)法縮小心梗面積。Fujita等〔14〕等對(duì)大鼠進(jìn)行缺血后適應(yīng)研究也發(fā)現(xiàn)后者可激活ERK1/2磷酸化，應(yīng)用ERK1/2的抑制劑可以取消后適應(yīng)所帶來(lái)的心肌保護(hù)作用。

本研究表明再灌注能誘導(dǎo)RISK信號(hào)通路活化；提示RS單次負(fù)荷劑量的確可產(chǎn)生再灌注心肌保護(hù)，其機(jī)制可能與RISK進(jìn)一步激活有關(guān)，RS所產(chǎn)生的有益影響可被PI3K抑制劑或ERK1/2抑制劑抵消，證實(shí)了PI3K/Akt和ERK1/2通路激活在RS組心肌保護(hù)中起重要作用。提示單獨(dú)使用PI3K抑制劑和ERK1/2抑制劑或即使合用RS均不能產(chǎn)生足夠的心肌保護(hù)。綜上，單次負(fù)荷劑量RS預(yù)處理可能通過(guò)激活RISK信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。但RISK信號(hào)通路中Akt與ERK1/2之間的關(guān)系及其深層機(jī)制仍待研究明確。

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